English文献解读|Nat Commun（14.7）：FH缺陷型肾细胞癌的全面分子分析可确定分子亚型和潜在治疗靶点
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论文ID
原名：Comprehensive molecular profiling of FH-deficient renal cell carcinoma identifies molecular subtypes and potential therapeutic targets
译名：FH缺陷型肾细胞癌的全面分子分析可确定分子亚型和潜在治疗靶点
期刊：Nature Communications
影响因子：14.7
发表时间：2025.05.12
DOI号：10.1038/s41467-025-59513-8
背 景
富马酸水合酶缺陷型肾细胞癌（FH 缺陷型 RCC）是一种罕见的肾细胞癌(RCC)疾病，由FH基因的双等位基因失活引起。虽然FH 缺陷型 RCC 罕见，但它几乎普遍致命，即使肿瘤很小也表现出明显的侵袭和转移趋势，这对治疗提出了重大挑战。FH 基因的缺失导致富马酸在细胞内积累，富马酸（又称为延胡索酸）是一种公认的致癌代谢物，可显著影响致癌信号传导、抗氧化反应和表型变化。这些影响包括：1) 抑制 αKG 依赖性双加氧酶，导致整体 DNA 和组蛋白高甲基化，以及 HIF1α2的稳定；2) 蛋白质琥珀化，激活抗氧化途径；3)诱导假缺氧状态，驱动代谢重组和细胞增殖；4)促进高甲基化表型，导致上皮-间质转化(EMT)和同源重组DNA修复缺陷；5)诱导线粒体DNA和RNA释放，驱动先天免疫和干扰素产生。然而，将这些见解转化为有效的靶向疗法仍然具有挑战性。
实验设计
结 果
01
FH缺陷型RCC的体细胞突变和拷贝数变异概况
从 2014 年到 2023 年，研究团队从多中心数据库中共提取了 126 名未经治疗的 FH 缺陷型 RCC 患者，并进行了基因组和转录组分析（图 S1a-b）。所有 126 名患者均获取了福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 样本，其中 116 名患者接受了肾切除术，10 名患者接受了肾活检。
对 71 个样本进行了全外显子组测序 (WES) 以检测基因变异，同时对另外 9 个样本进行了靶向基因测序(panel sequence)（图 S1b）。除了FH变异外，FH 缺陷型 RCC 中最常见的突变基因是TTN (20%，16/80)、NF2 (15%，12/80)、FAT1 (9%，7/80)、KMT2D (9%，7/80) 和MUC16 (9%，7/80)。虽然TTN和MUC16也是当前队列中最常见的突变基因（图 1a），但它们大多为乘客基因(passenger gene)。跨RCC类型的分析显示，在TCGA队列中，FH缺陷型RCC的突变谱与KIRC、KIPP或KICH（肾嫌色细胞癌）存在显著差异（图 1a）。
先前的研究表明NF2的体细胞突变促进肿瘤转移。在本研究的队列中，相关性分析显示，与不携带NF2突变的患者相比，携带NF2突变的肿瘤ISUP/WHO分级更高，Ki-67指数更高，同步转移发生率更高，尤其是骨转移。生存分析显示，同时存在的NF2突变可能会阻碍TKI单药治疗的有效性，而对免疫检查点阻断剂(ICB)加酪氨酸激酶抑制剂(TKI)联合治疗FH缺陷型RCC的疗效没有明显影响（图1b-c）。但由于样本量有限，且接受 ICB 加 TKI 治疗的NF2野生型患者的中位生存期未达到，这些差异需要进一步验证。
他们在FH缺陷型肾细胞癌中鉴定出三个显著的突变标记（M1、M2和M3）（图1d）。标记M1和M3分别对应COSMIC（癌症体细胞突变目录）标记SBS6（DNA错配修复）和SBS40（未知）。标记M2与COSMIC标记SBS22高度相似，后者与马兜铃酸暴露有关，马兜铃酸是一种中草药成分，与肾损伤和肾细胞癌致癌作用相关。相比之下，先前的研究报告称，SBS5和 SBS124在 ccRCC 和乳头状 RCC (pRCC)中更主要，而 SBS17在 chRCC中主要主要，表明与其他 RCC 亚型相比，FH 缺陷型 RCC 具有不同的突变谱。与具有种系FH突变的患者相比，具有体细胞FH改变的患者显示 SBS22 的贡献更高，证实马兜铃酸暴露可能是中国队列中体细胞 FH 缺陷型 RCC 的致癌因素。此外，他们发现与具有标记 M1 和 M3 的患者相比，具有标记 M2 的患者具有更高的 TMB 和截短突变负担（图1e）。生存分析进一步表明，具有 M2 标记的患者比具有其他标记的患者具有更高的复发风险（图1f）。
图S1. 研究设计概述。
(a)实验流程图。(b) 显示每个样本测序细节的热图。
图1. FH 缺陷型 RCC 的突变图谱。
(a) 热图显示 77 例 FH 缺陷型 RCC 病例的临床病理特征（上）。Oncoplot 显示了 77 例 FH 缺陷型 RCC 病例的体细胞变异的整体情况（下）。(b) Kaplan-Meier 曲线显示接受一线 ICB+TKI 或 TKI 单药治疗时有和无NF2体细胞突变的患者的 PFS。(c) Kaplan -Meier 曲线显示接受一线 ICB+TKI 或 TKI 单药治疗时有和无NF2体细胞突变的患者的OS。 (d) 在进行 WES 的 71 例 FH 缺陷型 RCC 病例中检测到三种主要突变特征，即 SBS6、SBS22、SBS40。(e) 箱线图使用 Kruskal-Wallis 检验展示了具有不同突变特征且贡献。(f) Kaplan-Meier 曲线显示具有不同突变特征的局部患者的 DFS。
02
FH 缺陷型 RCC 中FH变异的综合分析
最近的研究表明，FH的不同变异导致不同程度和机制的催化活性降低，这可能与 FH 缺陷型肾癌的肿瘤行为有关。因此，他们对本组 FH 缺陷型肾癌的FH变异模式进行了全面评估。在本研究的 126 例病例中共检测到159 种FH变异，包括 72例（45.3%）体细胞FH变异和 87 例（54.7%）种系FH变异（图 2a）。值得注意的是，他们观察到FH体细胞突变患者和种系突变患者的FH变异谱不同。与体细胞FH变异相比，错义突变对种系FH变异的贡献最大，而无义突变和大片段缺失在体细胞FH变异中比种系FH变异更常见（图2b）。共计66例FH基因存在2个突变，其中8例（12.1%）存在1个以上的FH突变，37例（56.1%）同时存在FH突变和杂合性缺失(LOH)，7例（10.6%）同时存在FH突变和FH基因启动子高甲基化，1例（1.5%）同时存在FH突变和1q缺失，11例（16.7%）同时存在大片段缺失和LOH，1例（1.5%）同时存在FH突变、大片段缺失和LOH，1例（1.5%）同时存在FH突变、大片段缺失和FH基因启动子高甲基化。
总共有 55 名（43.7%）患者表现出FH截短突变，52 名（41.3%）患者表现出FH非截短突变，其余 19 名（15.1%）患者含有FH大缺失（图 2c）。与含有 FH 非截短突变的肿瘤相比，在含有 FH 截短突变和大缺失的肿瘤中观察到 FH 的 mRNA 表达水平较低（图2d）。无义突变介导的衰变预计会降解截短突变的 mRNA，他们确实注意到一小部分病例在肿瘤细胞中通过免疫组织化学分析(IHC)显示保留的 FH 蛋白表达，并且几乎所有通过 IHC FH 蛋白表达较弱的病例都含有FH非截短突变（图 2e）。值得注意的是，与FH非截短突变和FH缺失的患者相比，FH截断突变的肿瘤更具侵袭性，具有更大的肿瘤大小和更高的 T 分期（图 2f）。此外，他们还发现了FH突变模式与 ICB + TKI 联合治疗的临床结果之间的关联（图 2g-h）。具体而言，与截短突变患者相比，非截短突变患者的 PFS 更长。而在接受 TKI 单药治疗的患者中，不同突变模式患者的 PFS 和 OS 无统计学意义。
图2. FH基因变异的综合分析。
(a) 棒棒糖图显示FH种系和体细胞变异的类型和位置。(b) 饼图显示体细胞（上）和种系（下） FH变异的变异类型分布。(c) 饼图显示三种 FH 变异亚型（非截短突变、截短突变、大片段缺失）的比例。(d) 箱线图显示不同FH变异亚型患者的FH mRNA 表达水平。(e) 条形图显示不同FH变异亚型患者IHC表达FH蛋白的比例。(f) 条形图显示不同FH变异类型患者T分期<3和≥3的比例。(g) Kaplan-Meier曲线显示接受一线ICB+TKI治疗的不同FH变异类型患者的PFS。(h) Kaplan-Meier曲线显示接受一线ICB+TKI治疗的不同FH变异类型患者的OS。
03
FH 缺陷型 RCC 中的甲基化模式以及 FH 缺陷型 RCC 甲基化特征的鉴定
合并FH缺陷型RCC和TCGA KIRP队列数据后，他们发现大多数FH缺陷型RCC病例属于CpG岛甲基化表型(CIMP)聚类，其余10例属于非CIMP聚类（图 3a）。与非CIMP肿瘤相比，CIMP表型的肿瘤具有更高的TMB负担、截断负担（图 3b）和22q中的缺失频率。转录组分析表明，与非 CIMP 肿瘤相比，CIMP 肿瘤中参与细胞周期和 EMT 通路的上调基因更丰富，提示 CIMP 表型肿瘤具有侵袭性。与这些结果一致，与非 CIMP 表型肿瘤相比，CIMP 肿瘤具有更高的复发倾向和同步转移倾向（图3c-d）。此外，有证据表明，与非 CIMP 肿瘤相比，CIMP 肿瘤的 DNA 甲基化特征明显更高。他们注意到CIMP肿瘤的PD-L1阳性率高于非CIMP肿瘤（图 3e）。
利用FH缺陷型RCC甲基化标记，KIRP队列中的5例病例归类为FH缺陷型RCC，并命名为“KIRP_suspicious_FH”（图 3f-g）。“KIRP_suspicious_FH”病例中的FH mRNA表达显著低于KIRP，但与TCGA队列中已知的HLRCC相当（图 3h）。值得注意的是，所有5例肿瘤均表现出FH缺陷型RCC的典型形态学特征，包括嗜酸性的胞浆、增厚的核膜、嗜酸性大的核仁、嗜酸性的大核以及核周晕（图 3i）。此外，他们还发现了两例 FH 缺陷型 RCC 病例，其FH基因拷贝数缺失（图 3i），强调了在诊断 FH 缺陷型 RCC 时额外进行 FH IHC 染色的必要性。
图3. FH 缺陷型 RCC 中的甲基化模式。
(a) 对 2000 个变异最大的 DNA 甲基化探针进行一维层次聚类。(b) 条形图显示了 CIMP和非 CIMP组中的患病率截短突变负担。(c) 条形图显示了 CIMP和非 CIMP组中的复发状态的患病率。(d) 条形图显示了 CIMP和非 CIMP组中的转移状态的患病率。(e) 条形图显示了 CIMP和非 CIMP组中通过免疫组织化学显示的 PD-L1 表达的患病率。(f) 对 42 个 CpG 位点进行一维层次聚类，使用FH 缺陷型 RCC 甲基化特征中的 42 个 CpG 位点，将 TCGA KIRP 队列中的样本分为三个聚类。(g) 主成分分析，分析基于源自 FH-deficient RCC 甲基化特征的 42 个 CpG 位点。(h) 箱线图描绘了FHTCGA数据库中KIRP、KIRP_FH、KIRP_suspicious_FH的mRNA表达水平。(i) 代表性H &E染色显示5个“KIRP可疑FH”样本的形态模式。
04
FH缺陷型RCC三种分子亚型的鉴定和表征
为了深入了解 FH 缺陷型 RCC 的生物学特征，他们采用了无监督共识分割方法40 来识别和细化基于转录的 FH 缺陷型 RCC 患者亚组。因此，使用来自基因集变异分析 (GSVA) 的 110 个特征识别出三个不同的聚类。为了阐明这些亚型的转录特征，他们通过将每个亚型与其他亚型进行比较，整合了差异表达基因(DEG)分析、基因表达定量集合分析 (QuSAGE) 和加权基因共表达网络分析 (WGCNA)。通过结合这些分析的结果，他们总结并细化了与 T 细胞炎症、血管生成、基质、MAPK/ERK、NOTCH、Wnt/β-catenin 和增殖相关的七个代表性基因特征（图 4 a-b）。
近一半的肿瘤归类为聚类1 (C1)，其特点是免疫原性和血管生成活性高，在 T 细胞炎症基因（如CD8A、IFNG、GZMB和CXCL13）和血管生成相关基因（如PECAM1和CXCL8）中表现出高度富集（图 4b）。这些肿瘤显示出最高的适应性和先天免疫细胞特征表达，包括 CD8+、CD4+、调节性 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞和树突状细胞，以及最高的血管生成评分（图 4c）。IHC结果显示这些肿瘤中 CD8+ T 细胞浸润增加（图 4d）、PD-L1 表达增加（图 4e）、核 HIF1A 染色最强以及血管密度增加。与其他两个聚类不同，聚类1 中的肿瘤表现出耗竭相关基因（CD274、TIGIT、HAVCR2、BTLA和PDCD1LG2）和耗竭评分高表达。多重免疫荧光进一步证实这些肿瘤基质中耗竭（PD-1+和 TIGIT+）和肿瘤反应性（CXCL13+）CD8+ 和 CD4+ T 细胞浸润增加（图 4f-g）。此外，聚类1中的肿瘤表现出更高的基质特异性基因表达，例如胶原蛋白的激活和基质相关基因的激活（例如FN1、COL8A1和MMP1）。因此，他们将该聚类标记为T效应/血管生成/基质。
约五分之二的肿瘤(C2)归类为第 2 类，其特征是血管生成和免疫基因均中度表达，而基质和细胞周期基因表达较低（图4b-c）。这些肿瘤显示 MAPK/ERK（例如MAPK3、MAPK7和MAPK12）、Notch（例如NOTCH1和NOTCH3）和 Wnt/β-catenin（例如WNT5B和DDK4）相关基因表达增加，这与透明细胞 RCC 的侵袭性特征相关（图 4b-c）。他们将此类肿瘤标记为 WNT/MAPK/Notch 类。
一小部分肿瘤归类为聚类3 (C3)，其特征是血管生成、基质和免疫基因表达低，但参与增殖转录途径的基因（E2F靶点和G2M检查点、MYC靶点和p53）富集。与其他两聚类肿瘤相比，聚类3中的肿瘤具有更高的细胞周期进展(CCP)评分和干性评分（图4b-h）。因此，他们将该聚类标记为增殖/干性。
图4. 转录分层识别具有不同生物学特征的 FH 缺陷型 RCC 肿瘤亚群。
(a) 热图表示每个聚类的 MSigDb 标志性基因集的 ssGSEA 得分。(b) 每个聚类的转录特征中包含的基因表达水平热图。(c) 箱线图描绘了不同聚类（C1-C3）的 T 效应子、血管生成、基质、MAPK/ERK、NOTCH、Wnt/β-catenin 和增殖特征的 Z 得分。(d) 条形图显示了不同分子亚型的 FH 缺陷型 RCC 中平均 CD8 IHC 表达 ≤50 个细胞/mm2和 >50 个细胞/mm2的肿瘤比例。(e) 条形图显示了不同分子亚型的 FH 缺陷型 RCC 中 IHC 表达阴性（TPS < 1%）或阳性（TPS ≥ 1%）PD-L1 的患者比例。(f) 箱线图显示了FH缺陷型RCC不同分子亚型中CD8+CXCL13+、CD8+ TIGIT+、CD8+PD1+、CD4+TIGIT+和CD4+PD1+细胞/mm2的数量。(g-h) 箱线图描绘了不同分子亚型 FH 缺陷型 RCC 中 CCP 评分和癌症干细胞评分的 ssGSEA 评分。
05
FH 缺陷型 RCC 分子亚型与 PD-1 抑制剂和 TKI 的分子特征和临床结果相关
接下来，他们探讨了临床和遗传特征与不同分子亚型之间的关联（图 5a）。值得注意的是，与其他聚类相比，增殖/干性 (C3) 聚类中的肿瘤具有高度侵袭性，其特征是肿瘤较大和淋巴结转移频率较高。形态学上， 呈现低度嗜酸性模式的肿瘤与良好的预后相关。有趣的是，所有具有低度嗜酸性模式的肿瘤均在 T 效应/血管生成/基质 (C1) 和 WNT/MAPK/Notch (C2)聚类中。与其他聚类相比，增殖/干性 (C3) 聚类中的肿瘤在 17q、16p和 16q以及FH截短突变中显示出更高的拷贝数增益频率。
他们继续评估每个组中 ICB 加 TKI 和 TKI 单药治疗的临床益处。关于联合治疗的疗效，C1 组患者的客观缓解率 (ORR) 有所提高且 PFS 延长，而 C3 组患者的 ORR 最差且 PFS 最短。C2 组的患者的临床益处介于 C1 和 C3 组之间（图 5b-c）。相反，无论分子分型如何，FH 缺陷型 RCC 患者均无法从 TKI 单药治疗中获得可接受的生存益处（图 5d）。
图5. FH 缺陷型 RCC 的分子亚型表现出不同的基因组、转录组和临床特征。
(a) 热图显示每个分亚聚类（C1，n = 27；C2，n = 23；C3，n = 6）的基因组、转录组和临床病理学特征。(b) 条形图描述了每个分亚聚类中接受一线 ICB + TKI 联合治疗或 TKI 单药治疗时实现 ORR 的患者比例。(c) Kaplan -Meier 曲线显示不同聚类中患者接受一线 ICB + TKI 时的 PFS。(d) Kaplan-Meier 曲线显示不同组别患者接受一线 TKI 单药治疗时的 PFS。
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结 论
本研究分析了FH变异模式与肿瘤异质性的关联，并开发了CpG位点特异性甲基化标记，以精确识别FH缺陷型RCC。转录组学分析揭示了三种独特的分子亚型，分别以免疫/血管生成/基质（C1）、WNT/Notch/MAPK（C2）和增殖/干性（C3）通路的富集为特征。C1型肿瘤从ICB和抗血管生成疗法的联合治疗中获得最显著的生存获益。C2型肿瘤对该疗法的反应中等。相比之下，C3型肿瘤对抗血管生成单药治疗及其与ICB的联合治疗反应不佳。这些发现有助于深入了解 FH 缺陷型 RCC 的侵袭性，为疾病管理的潜在精准医疗方法提供了见解。
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