文献解读|PNAS（11.1）：磷酸胆碱诱导的能量来源转移可减轻由地理特异性 PM 2.5成分引起的肺细胞线粒体功能障碍

空气污染，特别是空气动力学直径小于2.5 μm (PM2.5)的颗粒物(PM)，是一种严重的环境风险，据世界卫生组织称，每年约有700万人死亡与此有关。PM 2.5由于其异质成分不断变化，可能导致许多疾病。因此，了解造成 PM 2.5总毒性的基本成分以及它们在不同城市如何相互作用非常重要。

采样期间，太原和广州的PM 2.5平均水平分别为57.7 μg/m 3和39.9 μg/m3，超过了中国推荐限值（35 μg/m 3）和世界卫生组织（10 μg/m3）。研究者团队鉴定并定量了太原和广州 PM 2.5样品中的 82 种化学物质，涵盖离子、金属、多环芳香烃(PAH)、硝基-PAH(N-PAH)、羟基-PAH (OH-PAH)和 多环芳香族硫杂环(PASH)。总体来看，太原无论是总浓度还是单项浓度均较高，且季节性波动较为明显（图1 A-B）。各污染物的质量比例主要由其类型决定，彼此之间差异很大，两个城市的浓度差异接近10个数量级（图1B）。诊断率显示，大部分(72%)太原市PM 2.5样本的FLT/(FLT+ PYR)和IcdP/(IcdP + BghiP)比值均大于0.5，说明燃煤是太原市PM 2.5的主要来源之一（图1C）。两个城市的平均增量终生癌症风险 (ILCR)水平都随着年龄的增长而升高（图1D）。

在两个城市收集的PM 2.5样本中，暴露于BEAS-2B细胞的细胞毒性试验得出了不同的结果。夏季、秋季和春季采集的太原PM 2.5样品对细胞进行挑战，细胞活力在86 ~ 109%之间，与暴露于广州PM 2.5样品后的细胞活力范围（78 ~ 112%）相似（图1E-F）。细胞活力与太原冬季PM 2.5样本量呈负相关（图1E）。太原特定日期PM 2.5的毒性要比广州相同浓度的样本强得多（图1E）。然而，通过超氧化物歧化酶(SOD)测定，PM 2.5暴露在BEAS-2B细胞中引起的氧化应激与污染物样品的氧化电位无关（图1 I-J），这表明PM 2.5的毒性主要取决于成分的生物利用度及其与生物系统的相互作用。

图1. 2017年至2018年收集的太原和广州全年PM 2.5概况。

(A) 每个样品中 82 种主要化学物质的 Z 分数。(B) 化学品绝对浓度的季节性和年度平均值。 (C)诊断率分析。 (D) ICRL 分析。(E-F) 太原和广州的细胞活力随 PM 2.5浓度的变化。(G-H) DTT 活性随PM 2.5浓度变化。(I-J) SOD活性随DTT活性的变化。

他们对暴露于太原和广州PM2.5样本的BEAS-2B细胞进行了整体代谢组学分析。BEAS-2B细胞是一种永生化的人支气管上皮细胞，已知其反应与原代肺细胞相似，已广泛用于PM2.5毒性研究。PLS-DA图（图S5 A-B）显示了太原和广州样品引起的不同的代谢紊乱，而来自每个城市的PM2.5引起了细胞的特定变化。虽然不完全相同，但两个城市的PM2.5引起的代谢组变化相似，太原的PM2.5引起的代谢紊乱更为明显（图S5 C-G）。总的来说，太原和广州样本分别显著改变了49种和33种代谢物（图S5H）。这些代谢产物在暴露于两个城市的PM2.5后发生了相同的变化，太原污染物总体上导致了更大的变化。所有代谢物的变化随采样日期而变化（图S5H），表明细胞代谢紊乱可能与PM2.5的剂量和成分有关。富集分析表明，与氧化应激（嘌呤代谢和谷胱甘肽代谢）和氨基酸代谢（如苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢）相关的通路是显著的（图S5I-K）。相关分析鉴定出11个生物标志物与PM2.5成分(≥10个)显著相关（图2、图S6A-B），包括肌酸、谷胱甘肽(GSH)、磷脂(Pc)、6-磷酸果糖(F-6-P)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)、苯丙氨酸(Phe)、腺嘌呤、油酰胺、牛磺酸和N-乙酰-天冬氨酸(NAA)。值得注意的是，这11种细胞代谢物均未显示出与PM2.5总量的相关性（图2），这突出了PM2.5成分在毒性中的重要性。虽然PM2.5暴露导致38种代谢物增加，只有11种代谢物减少，但大多数代谢物在PM2.5处理后减少。

图S5. PM2.5暴露后肺细胞代谢组学分析。

(A)正模式的PLS-DA图。(B)负模式下PLS-DA图。(C)整体代谢组学分析检测出太原和广州PM 2.5暴露后BEAS-2B细胞中上调和下调的显著特征。(D)正负模式下不同特征数量的维恩图。(E-G)火山图显示代谢物丰度的变化。(H)太原和广州PM 2.5暴露鉴定的代谢物热图。(I) PM 2.5改变的显著通路富集分析。(J-K) PM 2.5暴露后BEAS-2B细胞的代谢网络。

图S6. 鉴定的代谢物与测定的组分之间的相关性分析。

(A-B)样品中鉴定的代谢物与PM 2.5组分的相关性分析。

图2. 从相关分析中选择的生物标志物。

然后，他们研究了PM 2.5暴露后对细胞代谢物的影响。补充Pc、牛磺酸和肌酸可以改善因 PM 2.5暴露而降低的细胞活力，表明这些化合物对 PM 2.5损伤具有保护作用（图 3 A-B）。人肺细胞线粒体是PM2.5细胞毒性的特异性靶点，已有研究证明了PM2.5侵袭后能量代谢对细胞存活的重要性。因此，他们评估了这些代谢物对细胞耗氧率(OCR)的影响。在正常生长条件下，这些代谢物都不会影响线粒体呼吸的效率（图3C-F）。然而，暴露于来自太原和广州的PM2.5后，Pc、UDP-GlcNAc和NAA可以显著增加细胞的基础呼吸、最大呼吸和三磷酸腺苷(ATP)的产生，表明这些代谢物在PM2.5阻碍的能量代谢中具有缓解作用（图3 G-N）。

图3. 选定的代谢生物标志物在暴露于 PM2.5后的细胞反应中的作用。

(A)暴露于 200 μg/mL PM2.5样品的 BEAS-2B 细胞的细胞活力的影响。(B) BEAS-2B 细胞暴露于含有不同浓度 Pc、牛磺酸和肌酸的200 μg/mL PM2.5样品中细胞活力的变化。(C-F)OCR、基础呼吸差异倍数、最大呼吸差异倍数和 ATP 生成的差异倍数。(G-J) OCR、基础呼吸差异倍数、最大呼吸差异倍数和 ATP 生成差异倍数。(K-N) OCR、基础呼吸差异倍数、最大呼吸差异倍数和ATP产量差异倍数。

虽然PM 2.5具有抑制作用，但葡萄糖氧化抑制剂UK5099显著降低了细胞的最大呼吸，而脂肪酸氧化抑制剂etomoxir处理却没有发生明显改变（图 4 A-B）。这些结果表明，无论是在正常情况下还是在应对 PM 2.5毒性时，肺细胞主要使用葡萄糖而不是脂肪酸来提供能量。有趣的是，Pc的施用仅在暴露于PM 2.5的肺细胞中显著增加了最大呼吸，在此过程中，etomoxir处理也起作用（图 4 A-B）。这些数据表明，应用Pc可以将细胞代谢重新编程为脂肪酸氧化，以满足PM2.5暴露期间能量供应的不足。

相关基因的表达进一步证实了这些反应。L-谷氨酰胺：果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)是己糖胺生物合成途径中的限速酶，并初始化代谢为UDP-GlcNAc。暴露于PM2.5后，GFAT显著下调，而在细胞培养基中加入UDP-GlcNAc与GFAT的下降有相互作用。O-linked β- n -乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)催化O-连 β-N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)对丝氨酸/苏氨酸蛋白残基的翻译后修饰。OGT的活性对其底物UDP-GlcNAc敏感。暴露于PM2.5后，OGT的表达也降低，并通过添加UDP-GlcNAc部分恢复。磷酸乙醇胺/磷酸胆碱磷酸酶1 (Phospho1)是控制Pc含量的主要酶。在正常细胞中，添加Pc对Phosoho1的表达没有影响。而暴露于PM2.5后，Phosoho1由污染物诱导大量上调，而Pc则显著抑制Phosoho1（图4C）。与此同时，调节氧化磷酸化的关键酶—过氧化物酶体增殖体激活受体γ辅助激活因子1- α (PGC-1α)的表达受到PM2.5的抑制，但其表达在Pc处理后恢复（图4D）。总而言之，这些结果表明，施用 Pc 确实将暴露于 PM 2.5的肺细胞的能量代谢转变为脂肪酸依赖性方式。能源的利用减轻了 PM 2.5引起的细胞功能障碍，这可能有利于细胞的生长。

图4. 生物标志物Pc对PM 2.5能量代谢障碍的缓解作用。

(A)OCR脂肪酸氧化测试。 ( B ) 补充 Pc后，最大呼吸相对于正常细胞的差异倍数。(C-D)在有或没有PM 2.5的细胞中添加Pc后Phospho1和PGC-1α表达的差异倍数。

如上所述，PM2.5样品的氧化电位和毒性并不完全取决于PM2.5浓度，而PM2.5的成分，特别是在太原，起着至关重要的作用（图1、图2）。这些成分的毒性不仅取决于其成分的浓度，而且取决于它们的毒性当量。为了评估环境标志物对PM2.5毒性的贡献，他们探索了与代谢变化相关的PM2.5成分。根据相关代谢物的数量和PM2.5各组分的浓度，他们从太原PM2.5中选择了6个环境标志物，命名为TY1。根据它们在冬季的平均浓度，他们列出Na+ (30 mM)、Ti (50 μM)、FLT (25 μM)、2-NFLT (1 μM)、2-OHFLU (5 μM)和1,2-d (0.5 μM)进行毒性分析。他们测试了所有64种组合，每种组合由TY1中的一到六种污染物组成。所有六种污染物的混合物使细胞活力降低至72%（图5A），略高于太原冬季样品造成的平均细胞活力。综合毒性分析的总体结果表明，有机成分中的化合物在引起PM2.5的毒性中起重要作用。太原的单一环境标志物不会产生ROS，但当浓度相当于200 μg/mL PM2.5时，所有六种环境标志物的混合物会以剂量依赖性方式诱导细胞中ROS释放（图5 B）。

此外，补充Pc还显示出针对TY1对线粒体功能的不利影响的保护作用（图5C-D） ，与太原PM 2.5样品的结果相似。此外，用TY1的混合物替换太原PM 2.5样品导致Phospho1和PGC-1α的表达模式相同（图5E-F）。综上所述，这些结果表明，TY1 组对肺细胞具有与太原 PM 2.5类似的细胞毒性，可以通过额外补充Pc 来减轻这种毒性。

图5. Pc对暴露于太原PM2.5样本中环境标志物混合物的细胞的有益作用。

(A) BEAS-2B 细胞暴露于 TY1 组的各种组合后的细胞活力。 (B)暴露于不同组合后ROS的产生。(C) 供应 Pc 后暴露于 TY1 的细胞的 OCR。 (D) 提供和不提供 PC 的 OCR 实验的不同读数的差异倍数。(E-F)添加Pc后TY1暴露细胞的Phospho1和PGC-1α表达差异的倍数。

本研究全面表征并比较了太原和广州两个地点的主要 PM2.5成分及其改变的代谢物。对长达一年的 PM2.5样本的分析揭示了 84 种主要成分，包括有机碳、元素碳、离子、金属和有机化学品。太原的PM2.5比广州的 PM2.5表现出更高的污染、相关的健康风险、二硫苏糖醇活性和细胞毒性。应用代谢组学方法，对暴露于两个城市PM2.5的 BEAS-2B 肺细胞进行了分析，揭示了两个地区PM2.5改变的代谢物以及PM2.5 的关键有毒成分。在PM2.5下调的代谢物中，磷酸胆碱有望成为PM2.5细胞毒性的干预靶点。它的补充通过激活脂肪酸氧化和抑制Phospho1表达，有效减轻PM2.5诱导的能量代谢紊乱和细胞死亡。本项研究提供了一种有前途的功能代谢物来缓解PM2.5引起的细胞紊乱，并提供了对有毒PM2.5成分的地理变异性的见解。

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