文献解读|（10.514）：单细胞转录组分析揭示小鼠中MicroRNA-126在时空水平上的胚胎内皮异质性和多功能性

基于此，作者想要评估发育ECs在时空水平上的转录异质性，并揭示特异性敲除内皮富含的microRNA-126（miR-126）时胚胎ECs聚集的变化。

收获第 14.5 天 (E14.5) 阶段四个野生型胚胎，获得 5806 和 6278 个 eEC（胚胎内皮细胞）并整合在一起。通过聚类分析确定了 11 个簇，并且从 M1和 M2分离的细胞得到了很好的整合（图 1A）。在各种器官或组织中建立的内皮细胞标记用于注释每个簇（图 1B）。脉管系统中的 EC 由血管 EC 和淋巴 EC 组成。大血管中的内皮细胞进一步分类为动脉内皮细胞和静脉 ECs。Foxf1 在肺 ECs38中高度表达，肾 EC 表达更高的基因Pbx1，Npr3 是心内膜的标记基因。Stab 2、Gata4 和 Oit3 在肝 ECs中高度表达。来自心脏的部分 aEC 与定义为心内膜的 eEC 重叠，这与心脏中 EC 的解剖分布一致。某些基因（肌肉中的 Actb、Fabp4和肠道 EC 中的 Apq710）分别在簇 0 和簇 1 中富集（图 1B）。作者推测簇 0 为肌肉 eEC，簇 1 为肠ECs 池。利用已发表的成年小鼠数据集，作者在图 2B 中用红色字体突出显示了一些基因，与 aECs 相比，这些基因在 eECs 中的表达相对较高。

总的来说，11 个异质的 eEC 簇按层次组织，就像脉管系统的解剖结构一样。eEC 包括淋巴 EC和血管 EC。血管 EC 包括大血管 EC和微血管 EC。作者还将一个簇确定为间充质转运的 ECs。

图 1. 胚胎第 14.5 天的内皮细胞 (EC) 分为 11 个群体

图 2. 在每个胚胎内皮细胞 (eEC) 群中高度且专门表达的基因

大血管标志物 Vwf 和 Vcam1 在一些动脉和静脉 EC 簇中富集，定义为动脉/静脉。毛细血管内皮细胞表达大血管和毛细血管标记，定义为毛细血管动脉/静脉。一些 EC 亚群表达Serpina1e 和 Alb（图 3A-C），在肝细胞中高度表达，作者将它们定义为器官浸润性 EC。

通过将 eECs 与 aECs （成人血管内皮细胞）整合，作者揭示胚胎期组织内以及 eECs 和 aECs 之间的异质性。大多数组织在大多数类型的 EC 中显示出相同的比例（图 3A-D 和 3E）。然而，eECs 在心脏 eECs和淋巴 eECs中显示出较高的增殖率。eEC 和 aEC 之间差异表达基因主要参与有丝分裂细胞周期、管形态发生和细胞增殖。增殖细胞在所有组织中显示出超过一半的比例。

图 3. 胚胎内皮细胞 (eECs) 组织中仍存在血管异质性，其增殖潜力高于成人 ECs (aECs)

与对照相比，miR-126-ecKO 胚胎显示出血管渗漏和皮下胚胎水肿和更高的致死率。胚胎淋巴和出生后视网膜中 ECs 的迁移和发芽受损，如血管面积减少（图 4A-B）。所有这些血管异常表明 miR-126-ecKO 小鼠脉管系统中的血管生成减少。

大多数EC的比例在 miR-126-ecKO 和同窝对照胚胎之间具有可比性（图 4C-D）。仅在 miR-126-ecKO eECs 中富集到10 个 GO 条目中有 5 个与缺氧有关（图 4E）。作者发现与缺氧相关的基因包括 Hif1a在miR-126 敲除后明显上调，并且心脏 ECs 中的表达谱高于同窝对照。在 miR126-ecKO 小鼠的胚胎皮肤和出生后视网膜区域发现过度血管生成（图 4F），意味着 miR-126 对胚胎期血管网络的稳态至关重要，敲除 ECs 中miR-126 会影响血管生成。

图 4. 敲除 microRNA-126 (miR-126) 扰乱了胚胎内皮细胞在发育过程中的聚集

来自肝脏的 eEC中簇 5 和 6 在 miR-126ecKO ECs 中变化最大（图 5A 和 B）。第 5 组和第 6 组中 DEG与葡萄糖调节和缺氧相关的多个GO 条目相关（图 5C）。miR-126-ecKO 小鼠对葡萄糖和丙酮酸的耐受性降低（图 5F-G）。结果表明 miR-126 在葡萄糖调节中的潜在功能。肝缺氧可能导致纤维化， miR-126-ecKO 小鼠的胶原纤维增加（图 5E）。

由 miR-126 缺乏引起的肝脏 eEC 杂乱无章，导致成年期肝纤维化和葡萄糖代谢异常。

图 5. 敲除内皮细胞 (ECs) 中的 microRNA-126 (miR-126) 会扰乱血糖代谢并诱导肝组织纤维化

间充质转运的 EC中簇 3 和簇 4 在 miR-126-ecKO eECs 中变化最大（图 6A-B）。第 3 组中 DEG与细胞外基质组织和骨骼系统发育相关的条目相关（图 6C）。富含细胞外基质和软骨的基因也在簇 3 中高度表达（图 6D）。miR-126 敲除 eECs 中存在过量的 EndoMT （内皮-间充质转化）(图 6E）。染色表明 miR126-ecKO 小鼠脑和肺中的血管钙化增加（图 6F）。

这说明 miR-126 的敲除通过内皮到软骨的转变导致血管钙化。

图 6. Tie2-cre 介导的 ECs 特异性miR-126-ecKO胚胎中的内皮间质转化和血管钙化增加

miR-126 在 ECs 中敲除时，肝 ECs 部分上调了与缺氧相关的基因。上调的缺氧相关基因最终诱导了GLUT1和 GLUT3的上调。最后，上调的 GLUT1 导致血糖代谢紊乱。HIF1A 和 GLUT1 在 miR126 缺陷型 eEC 中均表达更高（图 7A-B）。当 miR-126 敲除时，HIF1A 和 GLUT1 在肝 ECs 中均上调（图 7C-D）。

miR-126 敲除小鼠的血糖代谢破坏（图 5E），重要的是要知道恢复 miR-126 是否能恢复缺陷。通过尾静脉注射用 miR126-3p agomir 治疗，显示miR-126 敲除小鼠的血糖耐受性显著恢复（图 7E-F）。结果表明miR-126Hif1a-Glut1通路参与了小鼠体内的血糖代谢。

图 7. HIF1A-GLUT1 通路在 microRNA-126 ECs中上调，miR-126-3p agomir 恢复糖代谢

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