文献解读|Food sci hum well（8.022）：粪便代谢组学揭示蜂胶乙醇提取物对II型糖尿病（T2DM）小鼠积极作用

糖尿病发病期间，机体会消耗大量的脂肪和蛋白，因此在EPP治疗前，T2DM小鼠体重显著低于对照组。使用低剂量EPP（EPP-L）和高剂量EPP（EPP-H）治疗后，小鼠体重下降趋势减慢，且呈现剂量依赖性（图1A）。这表明EPP可以有效减缓糖尿病小鼠的体重损失。在EPP治疗前，T2DM小鼠空腹血糖（FBG）含量显著高于对照组。随着EPP治疗时间延长，对照组小鼠FBG保持相对稳定，而EPP-L 和EPP-H组小鼠FBG显著低于T2DM组（图1B）。    

为了探究EPP对胰岛素抵抗的治疗效果，作者检测了EPP治疗28天后小鼠空腹胰岛素(FINS) 水平和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。结果表明，EPP治疗前，T2DM组的FINS水平显著高于对照组，表明T2DM出现胰岛素抵抗。而与T2DM组相比，EEP-L和EEP-H组的FINS水平显著降低，EEP-H组的效果更好（图1C）。同时，HOMA-IR结果显示，与T2DM组相比，EEP-L和EEP-H组的HOMA-IR指数也显著降低 (图1D)，这表明EEP可以增强胰岛素敏感性并降低胰岛素抵抗水平。

图1 EPP治疗对T2DM小鼠体重、血糖和胰岛素的影响

T2DM小鼠血清总胆固醇（TC）含量与对照组相比无显著差异，在EPP治疗后出现显著下降；与对照组相比，T2DM小鼠甘油三酯（TG）含量显著下降，经EPP治疗后，TG含量进一步下降（图2A，B）。此外，T2DM小鼠血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）较对照组相比显著增加，在EPP-L治疗后轻微增加，但无显著差异，而在EPP-H治疗后出现显著增加，而低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）则在四组之间均无显著差异（图2C，D）。

由于糖尿病患者体内葡萄糖含量增加会导致肝损伤，从而释放转氨酶进入血液。T2DM小鼠血清谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量均显著高于对照组，但是在EPP治疗后，AST和ALT含量出现显著下降（图2E，F），这表明EEP具有一定程度的肝修复功能。

图2 EPP对血液生化指标的影响

肝脏组织病理学HE染色分析结果表明：

（1）对照组肝细胞形态正常，肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，肝窦无明显扩张或变窄，未见明显肝细胞退行性病变和坏死，未见明显炎症细胞浸润（图3A）；

（2）T2DM组肝细胞严重受损、肿胀，肝脏狭窄，局部静脉周围可见少量淋巴细胞浸润 (黄色箭头)，肝细胞炎性坏死 (蓝色箭头)、细胞核碎裂、细胞质嗜酸性粒细胞增多（图3B）；

（3）EEP-L组肝小叶结构较清晰，仅部分肝细胞有轻度颗粒变性 (黑色箭头)，未见明显炎性细胞浸润（图3C）；

（4）EEP-H组肝小叶结构更清晰，部分肝细胞胞浆内可见微小空泡 (蓝色箭头)，未见明显炎性细胞浸润（图3D）。

这表明EEP对T2DM引起的肝损伤有较好的修复功能，可以减少慢性肝病及其并发症的发生。

图3 EEP对T2DM小鼠肝损伤的影响

主成分分析（PCA）显示了各组代谢物总体差异。与T2DM组小鼠相比，在EPP治疗后，小鼠粪便代谢组出现明显差异（图4A-C）。进一步使用OPLS-DA模型来更好的区分组间的代谢物，从得分图来看，对照组和T2DM小鼠之间分离程度大，表明T2DM小鼠建模成功（图5A）。此外，EPP-L、EPP-H组与T2DM小鼠之间的差异也很大，表明EPP对T2DM小鼠粪便代谢组产生影响（图5B，C）。同时，为了防止模型的过度拟合，作者使用了七重交叉验证和200个响应排列测试 (RPT) 来评估模型的质量，结果如图5D-F所示：OPLS-DA分析显示Q2的回归线在纵坐标上的截距小于0，表明不存在过度拟合，数据可用于后续的代谢组学研究。

图4 四组小鼠粪便代谢谱PCA分析

图5 四组小鼠粪便代谢谱PCA分析及OPLS-DA置换检验图

代谢组分析一共鉴定出27种潜在代谢标志物，其中11种为负离子筛选，16种为正离子筛选，这些代谢物主要参与甾醇脂质、脂肪酸、甘油磷脂、甘油脂质等代谢通路（表1）。与对照组相比，T2DM小鼠中有16种代谢物显著降低，7种显著增加，4种水平接近。而在EEP治疗后，与T2DM组相比，EEP-L组的6种代谢物显著降低，12种显著增加，9种无显著变化；EEP-H组有8种显著降低，19种代谢物显著增加（图6）。

在这27种代谢物中，有很多和糖尿病进程相关的代谢物。PI (36:1)参与糖尿病及其并发症的发生，而PE-NME2 (46:3)是卵磷脂的组成部分，卵磷脂可增强胰腺功能。与对照组相比，T2DM小鼠粪便PI(36:1)水平增加，PE-NME2 (46:3)水平降低，这符合预期。但在EPP治疗后，与T2DM组相比，EEP-L组和EEP-H组可显著降低粪便PI (36:1)水平，增加PE-NME2 (46:3)水平，这表明EEP治疗可以有效调节T2DM小鼠的脂肪酸代谢，减缓糖尿病进程。此外，EPP治疗还可以增加粪便中与炎症、抗氧化、胰岛素分泌等相关的代谢物水平，如LacCer (d42:1)，光色素和NAGly，表明EEP可以增强T2DM小鼠的抗炎能力、抗氧化能力和胰岛素分泌能力，最终达到治疗缓解糖尿病的目的。

表1 潜在生物标志物鉴定

图6 粪便中27种代谢物的相对含量

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