文献解读|Food Chem (8.8)：蛋白质组学和代谢组学揭示石凉茶两个品种(柳叶蜡梅和浙江蜡梅)器官间抗氧化活性差异的机制

石凉茶是一种优良的功能性绿茶，因其消食健脾、抗菌消炎、降血脂、止泻等功效显著而成为各个家庭喜闻乐见的健康饮品。柳叶蜡梅(Chimonanthus salicifolius)和浙江蜡梅(Chimonanthus zhejiangensis)是制备石凉茶最常见的两个品种，它们的叶片和枝条在制茶过程中得到了广泛的应用。在柳叶蜡梅中已鉴定出多种次生代谢产物，然而，目前还没有相关文献对浙江蜡梅中的次生代谢产物进行分析，且有关二者黄酮类化合物的抗氧化能力以及在不同器官中的分布尚未被研究，这在很大程度上限制了植物资源的有效开发和利用。

为了揭示柳叶蜡梅(CS)和浙江蜡梅(CZ)叶片(CSL、CZL)和枝条(CSB、CZB)之间的生物学功能差异，鉴定了CSL、CSB、CZL和CZB之间的DAPs(差异蛋白)，并对其相关代谢过程进行了蛋白质组学分析。CSL与CSB和CZL与CZB相比，两个物种枝条中丰度较高的DAP数量多于丰度较低的DAP数量，这些DAP与光合作用、RNA代谢、氧化还原和四吡咯合成有关(图 1A)。此外，还比较了柳叶蜡梅和浙江蜡梅叶片和枝条中的蛋白质丰度模式。结果显示，相比于CZL，参与细胞、转运、氨基酸代谢、光合作用、微量碳水化合物(CHO)代谢、糖酵解和四吡咯合成相关的蛋白质在CSL中更丰富(图 1B)。

图1 DAPs的功能分布

为了评估胁迫和氧化还原代谢的功能水平，测定了两种植物器官中抗氧化酶包括SOD、POD、CAT、GSH-PX和胰蛋白酶/蛋白酶抑制剂的活性(图 2)。结果表明，柳叶蜡梅和浙江蜡梅枝条中SOD活性均显著高于叶片。CSB的SOD活性低于CZB。两树种各器官中GSH-PX活性与SOD活性基本一致。CZL中CAT活性高于CZB，而POD活性在两种植物不同器官间无显著差异。这些结果表明两种植物的胰蛋白酶/蛋白酶抑制剂活性在枝条中比在叶片中更强。此外，采用ABTS自由基清除实验评价各器官甲醇提取物的抗氧化活性(AA)。柳叶蜡梅枝条的AA是叶片的2倍。在浙江蜡梅中，AA在枝条中比在叶片中更高。

图2 抗氧化酶、胰蛋白酶抑制剂和AA的分析

接下来，进一步分析了次级代谢相关DAPs (SMDs)。对69个SMDs进行聚类分析，发现5个亚群(I、II、III、IV、V)，分别包含5、19、8、4和33个SMDs (图 3)。在SMDs中，分别有22个、22个和19个DAPs在功能上参与了类异戊二烯、类黄酮和苯丙素的生物合成(图 3B)。亚群I的CSB丰度高于其他器官的SMDs，主要与类异戊二烯和类黄酮生物合成途径有关。亚群II主要含有类黄酮和苯丙素相关的DAPs，在柳叶蜡梅和浙江蜡梅枝条中的含量均高于叶片。将CZB和CZL中丰度最高的SMD分别归为亚群III和IV，发现它们主要参与类黄酮和苯丙素生物合成途径。最后，亚群V中主要含有与类异戊二烯相关的DAPs，在两个物种中叶中的含量均高于枝中的含量。

图3 次生代谢相关DAPs的聚类分析和功能分类

为了进一步探究器官间类黄酮组成的蛋白质组学结果，对类黄酮进行了鉴定和代谢组学分析。经PCA分析发现，在PC1中，柳叶蜡梅和浙江蜡梅的枝条与叶片均有较好的分离(63.5%)，在PC2 (33.7%)中，CSB与CZB也有较好的分离(图 4A)。生成的Venn图显示了四种样品类型的代谢物的重叠情况，CSL、CSB、CZL和CZB中分别有149、143、149和127种代谢物，四组中有112种代谢物重叠，在叶片和枝条中分别检测到11种和4种代谢物，4种代谢物在柳叶蜡梅中特异存在，1种代谢物在浙江蜡梅中特异存在(图 4B)。鉴定到的代谢物主要为黄酮醇、简单类黄酮、黄烷醇和花青素(图 4C)。此外，CZB中黄酮醇的数量少于其他样品(图 4D)。总体而言，类黄酮成分在各器官间无显著差异。

图4 柳叶蜡梅和浙江蜡梅器官的代谢组学分析

由于两种植物中类黄酮相关蛋白在枝条中比叶片中更丰富，通过检测类黄酮的差异情况进一步评估了器官间类黄酮代谢的差异。共鉴定出159个差异积累的黄酮类化合物。图5显示，CSL中黄酮醇、花青素和黄酮苷的水平高于CSB，而黄烷醇、原花青素(PAs)、二氢黄酮醇和查尔酮的水平低于CSB。然而，在浙江蜡梅中，叶片中黄酮醇、二氢黄酮醇和黄烷酮的含量高于枝条，而黄烷醇、PAs、异黄酮和查耳酮的含量低于枝条。有趣的是，与叶片相比，PAs是两个物种中枝条中最丰富的化合物。在这两个物种中，CZL中检测到的黄酮类化合物的含量显著高于CSL。然而，黄酮醇、黄酮、黄烷醇、黄酮苷和PAs在柳叶蜡梅枝条中的含量高于浙江蜡梅。

图5 差异积累的黄酮类化合物在柳叶蜡梅和浙江蜡梅器官中的分布

两种植物中PAs在枝条中的含量均高于叶片。进一步分析了柳叶蜡梅和浙江蜡梅不同器官中PA相关化合物的水平。图6显示，7种PAs在柳叶蜡梅和浙江蜡梅枝条中的含量均高于叶片。其中，柳叶蜡梅枝条中原花青素B1、B4、C1、C2和没食子儿茶素-儿茶素-儿茶素含量均高于浙江蜡梅。

图6 不同器官间PAs分析

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