文献解读|EBioMedicine（11.205）：尿液蛋白质组特征预测癌前病变向恶性胃癌的进展

首先，作者总共鉴定出3540个高度可靠的尿蛋白(图1a)，其中688个蛋白质在超过50%的胃病灶和GC样品中都有检测到。质控样品的Spearman相关系数在0.80~0.91之间，表明LC-MS/MS的批间仪器重现性较高(图1b)。此外，所有样品在尿蛋白质组定量中都表现出良好的一致性，支持其稳定性和可靠性(图1C)。

图1 LC-MS/MS的蛋白质鉴定和质量控制概述

在偏最小二乘判别分析中，作者观察到胃癌和其他胃病灶之间不同的尿蛋白谱(图2a)。在发现和验证集中，在GC和其他胃病灶(SG/CAG或IM/LGIN)中筛选出VIP>1的139个蛋白质。接着，作者为了探索不同胃病变和GC之间尿蛋白水平的变化轨迹，通过无监督分层聚类将这139种尿蛋白分成了六个Cluster，显示了从癌前病变到GC的动态变化(图2b)，以及139种蛋白质及其聚集簇的显著富集途径(图2c)。前两条富集途径分别聚集在Cluster2(碳代谢途径)和Cluster1(淀粉和蔗糖代谢途径)中。Cluster2蛋白含量最大，在胃轻中度病变和进展期病变中表达变化不明显，但在胃癌中表达显著增加。相反，Cluster1蛋白在胃癌中的表达下降。Cluster3蛋白随着胃黏膜病灶向胃癌的发展呈持续下降趋势。

接着，作者发现139个VIP>1的蛋白中82个蛋白在发现阶段与胃癌的风险呈显著相关(P<0.05)，其中43个蛋白在验证集中确定为GC的差异表达蛋白质(DEP)(28个上调，15个下调)，涉及GC与SG/CAG的32个显著蛋白，以及GC与IM/LGIN的30个显著蛋白(图2d)。通过可视化这43个DEP的蛋白质簇和网络，发现许多DEP呈正相关(图2e)。此外，蛋白质-蛋白质相互作用网络获得了前15个潜在的核心蛋白(图2f)。

图2 胃癌及癌前病变患者尿液蛋白质组学特征及差异表达蛋白的研究

A.偏最小二乘法-DA图。B.从SG/CAG到IM/LGIN再到GC的蛋白质变化轨迹。C.前15个蛋白质的富集化途径。D.与SG/CAG(左)或IM/LGIN(右)相比，共有43个与GC显著相关的DEP。正相关的蛋白质(OR>1)用红色表示，负相关的蛋白质(OR<1)用蓝色表示。E. 43个DEPs的Pearson相关性分析。F. PPI网络。

通过前瞻性随访患者(n=60)，作者进一步验证了上述43个DEP是否与胃部病变的进展有关。在随访期间，18名患者的胃部病变进展到更严重的水平，其中2位发展为GC。在发现集和验证集中，GC中四种上调的尿蛋白与胃损伤进展的风险增加显著相关(P<0.05)，包括ANXA11、CDC42、NAPA和SLC25A4(图3a,b)。这四种蛋白质都聚集在Cluster2中，并在胞吞(CDC42)、cGMP-PKG信号通路(SLC25A4)和突触小泡周期(NAPA)中富集(图2c)。在PPI网络分析中，SLC25A4也显示为核心蛋白(图2F)。分层分析发现，无论是轻度胃病变组(SG/CAG)还是晚期胃病变组(IM/LGIN)，进展期患者的这四种蛋白水平始终较高。

接着，作者计算了四个关键尿蛋白的蛋白质分数，发现与轻度(SG/CAG)或进展期 (IM/LGIN) 胃病变相比，蛋白质评分与胃癌的风险独立相关，每增加一次SD评分，OR值(95%CI)分别为2.13(1.38~3.28)和2.43(1.50~3.95)。此外，蛋白质评分与胃病变进展的风险显著相关(OR=3.63，95%CI：1.49-8.81)(图3c)。

与包括年龄、性别和基线病理(用于预测进展风险)的模型相比，综合蛋白评分显著提高了预测胃癌风险的能力(GC vs SG/CAG：AUC(95%CI)：0.81(0.73-0.89) vs 0.63(0.51-0.76),P=0.0024; GC vs IM/LGIN; AUC(95%CI)：0.84 (0.77–0.92) vs 0.63 (0.51–0.76), P= 0.0007；胃病变进展(AUC(95%CI)：0.92(0.83-1)vs.0.62(0.46-0.77)， P=1.99×10−10)(图3d-f)。

图3. 与胃病变进展和胃癌风险相关的蛋白质组学特征

a.四个突出显示蛋白质的相对丰度; b.进展期(n=18)和非进展期(n=42)在随访期间四种蛋白的表达; c.蛋白质评分与胃病变进展和GC发生风险之间的关系。d,e:模型1包括年龄和性别，模型2包括模型1和四种蛋白质的蛋白质分数。f:模型1包括年龄、性别和基线胃组织病理学,模型2包括模型1和四种蛋白质的蛋白质特征。

作者发现在上述43个尿液蛋白中，在胃组织标本中可检测到其中的34种，因此他们比较了它们在GC和非GC组织中的组织表达。其中，21种组织蛋白的相关性与尿液水平的相关性是相同的，而且只有13种组织蛋白的相关性有统计学意义。GC中三种组织蛋白(ANXA11、CDC42和NAPA)的水平显著升高，进展期患者的胃组织中这三种蛋白的表达水平也高于非进展期患者(图4)。

图4 对34个选定的蛋白在GC和癌前病变之间的尿液和组织水平的表达的系统聚类。与GC呈正相关(OR>1)的蛋白质以红色表示，呈负相关(OR<1)的以绿色表示，与胃癌风险显著相关的组织蛋白用*标记。

作者使用蛋白质组学反卷积分析的Nuwa通道，利用尿蛋白组学图谱来估计每个患者10种主要免疫细胞类型的相对比例，发现尿中两种关键蛋白(CDC42、SLC25A4)水平和蛋白质评分与CD8+T细胞和NK细胞比例显著相关，但相关系数仅表现为弱至中度相关(图5a)。

根据每个患者免疫细胞的估计比例得出三个免疫簇(IC)(图6a)，三者中10个主要免疫细胞的丰度在统计学上都有显著差异，中性粒细胞具有最低的P值(图6b)。而且他们在免疫细胞类型上有不同特征，IC1以高比例的CD4+T细胞和树突状细胞为特征，IC2以丰富的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞为特征，IC3以丰富的CD8+T、NK细胞和B细胞为特征(图5b,6b)。

此外，GC患者倾向于在具有上调CD8+T和NK细胞（图5d）的IC3中富集（图5c，P=0.013），其可进一步分为六个细胞亚群，导致与癌前病变相比，GC中显著上调的CD8+效应记忆细胞重新表达CD45RA（CD8+TEMRA）、CD56dim和CD56bright NK细胞（图5e）。

图5 基于尿液蛋白质组学数据的免疫聚类及免疫细胞与突出蛋白质之间的关联

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