文献解读|Nat Commun（16.6）：上皮性卵巢癌的蛋白质组学特征描绘了不同组织学亚型的分子特征和治疗靶点

透明细胞癌(CCC)、子宫内膜样癌(EC)和浆液性癌(SC)是上皮性卵巢癌(EOC)的主要组织学亚型，其致癌机制的差异仍不清楚。

研究者团队收集了239 个 EOC 样本和30 个 对照(CT) 样本进行蛋白质组学分析（图1a），在所有肿瘤样本中总共鉴定出 8257 个蛋白质。统一流形近似和投影(UMAP)分析证明肿瘤和非肿瘤样本的蛋白质组以及EOC病理亚型之间存在明显区别，这进一步凸显了肿瘤样本之间的高度异质性（图1b）。为了更好地描述 EOC 的肿瘤间异质性，他们对病理亚型之间的患者临床信息进行了表征。与 EC 和 CCC 相比，SC 患者诊断时年龄较大，且容易复发（图 1c）。此外，SC 比 EC 和 CCC 更富含晚期肿瘤（图 1d）。特别是，对EOC组织学亚型的生存特征的评估表明，SC、EC和CCC表现出显著不同的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)（图 1e）。其中，SC 的生存率明显较低，术后死亡和复发风险较高，中位 OS 为 47.57 ± 2.36 个月，中位 RFS 为 16.57 ± 2.50 个月。他们发现大多数检测到的蛋白质来自细胞核、质膜和线粒体，这意味着潜在的蛋白质靶标和失调的生物过程 (BP) （图 1f）。

图1. EOC 组织学亚型的蛋白质组图谱。

(a) 基于 MS 的蛋白质组分析流程。 (b) 上皮性卵巢癌 (EOC) 肿瘤和对照组织 (CT) 样本的 UMAP 图。(c) 热图显示样品的临床信息和平均蛋白质丰度。(d) EOC 组织学亚型丰度在肿瘤分期方面的差异。(e) EOC组织学亚型的总生存期 (OS)和无复发生存期 (RFS)的 Kaplan-Meier 图。(f) 蛋白质亚细胞定位示意图。

根据蛋白质组数据鉴定了肿瘤中失调的蛋白质，肿瘤样品中分别有 295 个和 927 个蛋白质显著上调和下调（图2a）。GO分析表明，bp中显著富集下调蛋白，这些蛋白与细胞死亡、DNA修复/损伤、发育和免疫反应等有关，而bp中富集上调蛋白的数量有限（图2b）。在肿瘤样本中，在KEGG通路、DNA复制、细胞周期、HIF-1信号通路和几种代谢相关通路在富集了上调蛋白，而PI3K-Akt信号通路、局灶黏附和细胞外基质(ECM)受体相互作用富集了下调蛋白（图2c）。癌症标志的基因集富集分析(GSEA)分析显示，雌激素反应和氧化磷酸化标志蛋白在卵巢癌中表达上调，而凋亡、上皮间充质转化(EMT)、TNF- α信号通路和其他信号通路蛋白在卵巢癌中表达下调（图2d）。

为了区分肿瘤和正常样本，他们使用差异表达蛋白作为初始特征。然后，使用曲线下面积(AUC)来评估每个特征的分类性能。具有区分特征的蛋白与外泌体蛋白有重叠（图2e），这些重叠蛋白可能为EOC研究提供更丰富的视角。

图2. 通过蛋白质组分析鉴定失调的蛋白质和通路。

(a) 火山图显示肿瘤中蛋白质的上调或下调。 (b) 按不同类别着色的条形图显示了失调蛋白质的富集生物过程 (BP)。 (c) 富集 KEGG 通路的条形图，粉色条表示富含上调蛋白的通路，绿色条表示富含下调蛋白的通路。 (d) GSEA 结果显示在代表癌症特征的标记集背景下评估的特征。 (e) Lollipop图显示蛋白质的差异倍数，森林图显示这些蛋白质的曲线下面积 (AUC)。

由于蛋白质组学分析揭示了几种信号通路的干扰，他们接下来试图从多组学的角度来阐明这种干扰。在这里，他们整合了先前发表的磷酸蛋白质组数据（CPTAC 队列）和磷酸蛋白质组分析确定的上述途径中这些蛋白质的失调磷酸位点。他们发现DNA复制途径中的蛋白质表现出整体上调模式，而失调的磷酸化位点在Gap 1期、Gap 2期和有丝分裂期表现出更复杂的模式。HIF-1 信号通路也富含上调的蛋白质，而这些蛋白质的磷酸化在 CPTAC 队列中受到抑制。此外，他们发现 ECM 受体和 PI3K-Akt 信号通路富含下调蛋白，磷酸位点也显示出下调模式（图3a）。

通过单变量回归分析评估上述多种途径中失调蛋白的临床关联。多个众所周知的治疗靶点，例如 CDK4、CDKN1B 和 COL1A2，对于 EOC 的死亡率预后显示出非常高的风险评分（图3b）。此外，包括COL1A1、COL1A2和COL6A3在内的ECM受体成员与RFS相关，并且在肿瘤样本中的表达显著低于对照，较低的表达与较长的存活率相关（图3b），这表明介导细胞和基质成分之间关联的受体在 EOC 中发生了改变。在这些靶向蛋白中，CDK4、CDKN1B 和 COL1A2 在 EOC 的 OS 和 RFS 中都显示出非常高的风险评分（图3b）。

图3. EOC 中的信号通路紊乱提示了治疗机会。

(a) KEGG 通路中的异常蛋白质。 (b) 热图显示四种途径中蛋白质的表达，森林图显示使用 Cox 分析的蛋白质高风险(HR)评分 。

为了从整个蛋白质组的角度研究本项研究队列的生物学特征，他们使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建了基于蛋白质表达谱的蛋白质共表达网络，并鉴定出多达 58 个共表达 EOC 模块。其中，通过GO注释探索每个模块的富集的BP，进一步提取了41个模块，重新构建出具有896个节点和13574条边的蛋白质共表达网络，该网络注释有每个模块的不同生物学功能（图4a）。如最大的共表达模块Module4，主要参与核酸转运、RNA剪接、RNA定位等。Module11 显示了与 Module4 类似的主要功能。同样，多个模块中的蛋白质参与 DNA 修复（Module9 和 Module16）、运输（Module27、Module45 等）和定位（Module14）。Module1作为第二大共表达模块，与多种重要的免疫功能相关，如急性炎症反应、体液免疫反应和免疫效应过程等。此外，Module18、Module36和Module12在免疫相关BP中也显著富集。

在共表达网络中，41.34% 的蛋白质-蛋白质相互作用是 STRING 数据库 ( https://cn.string-db.org/ )中已知的相互作用（图4b）。当每个致病类别的相对蛋白质丰度叠加在网络上时，识别出在三种组织学亚型之间具有差异调节的多个模块（例如Module31、Module7、Module18等）（图4c）。

特定模块的蛋白质异常和功能变异是必需的。有趣的是，Module31的蛋白不仅在不同的组织学亚型中存在差异表达（图4d），而且在晚期（III期和IV期）也高表达，阐明了肿瘤进展的分子动力学（图4e）。特别是，IFIT3表达较高的患者明显更短的OS时间（图4f），表明IFIT3可能是EOC的候选生物标志物和进展标志。

图4. 蛋白质共表达网络和肿瘤进展标志。

(a) 具有 896 个节点和 13574 个边的蛋白质共表达网络。(b) 网络中显示的相互作用的成对蛋白质-蛋白质相关性的密度图。(c) 每个组织学亚型的异常蛋白表达水平叠加在网络上。(d) Module 31 的子网。 (e) 箱线图显示IFIT1、IFIT2和IFIT3在不同组织学亚型中的丰度。(f) IFIT3 的 Kaplan-Meier 生存曲线。

为了深入了解不同亚型之间区分的蛋白质，我们应用 KW 检验来识别三种组织学亚型中差异表达的蛋白质。鉴定了 861 个 CCC 特异性蛋白、423 个 EC 特异性蛋白和 1094 个 SC 特异性蛋白（图 5a）。接下来，他们对亚型特异性蛋白质进行了功能富集分析，其中 GO 类别根据功能主题进行分组。CCC特异性蛋白在细胞脂质分解代谢过程、翻译起始和己糖代谢过程等代谢过程中富集。EC特异性蛋白在病毒过程抗原加工和呈递中富集。SC特异性蛋白质在细胞内运输和细胞通讯中富集，例如含有蛋白质的复合物定位和底物黏附依赖性细胞扩散（图 5b）。他们使用 Metascape 分析探讨了通路的生物学意义。CCC 特异性蛋白在 PI3K-Akt 信号通路、柠檬酸 (TCA) 循环和呼吸电子传递以及 ECM-受体相互作用等通路中富集。EC 特异性蛋白在 MHC II 类抗原呈递、选择性自噬和氧化损伤反应等途径中富集。SC特异性蛋白在程序性细胞死亡、B细胞中NF-κB激活和VEGFA-VEGFR2信号通路等途径中富集（图 5c）。所有三种亚型特异性蛋白均涉及 Rho GTPases 相关的信号传导途径（图 5d）。

图5. 亚型特异性蛋白质的比较和表征。

(a) 维恩图显示了不同 EOC 亚型中报道的差异表达蛋白的重叠。(b-c) GO 分析和富含差异表达亚型特异性蛋白质的和分子途径。 (d) 亚型特异性蛋白质在 Rho GTPases 信号转导通路中富集。

他们试图为每种组织学亚型寻找潜在的药物靶点。首先，将EOC和CT中差异表达蛋白与亚型特异性蛋白的交集用作候选蛋白列表。然后，根据 Kaplan-Meier 曲线和 Cox 回归分析，确定了每种组织学亚型的独立且显著的预后蛋白。在 CCC 中，与其他两种亚型相比，CSPG4 表达量较高。此外，CSPG4仅在CCC中具有预后价值，而在其他组中没有预后价值（图 6a-b）。TMEM87A的低表达主要见于EC，并且与EC患者的良好预后结果显著相关（图 6c-d）。MMP7蛋白显示出作为SC治疗靶点的巨大潜力，具有亚型特异性高表达和预后能力（图 6e-f）。MPP7 的预后价值也在 CPTAC 数据集中得到了验证。

细胞周期的流式细胞分析表明，MPP7敲低导致S期细胞减少，G1和G2期细胞增加（图 6g-h），表明MPP7参与了G1-S和S-G2转变的调节。

图6. 不同组织学亚型的潜在治疗靶点。

(a,c,e) CSPG4、TMEM87A 和 MPP7 在各自组织学亚型中的表达水平。 (b,d,f)生存曲线分析。(g-h)流式分析。

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