文献解读|Nat Genet（30.8）：BCR-ABL1淋巴细胞白血病的转录组分类

在BCR-ABL1淋巴细胞白血病中，酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 的治疗异质性，特别是在BCR-ABL1不存在激酶结构域突变的情况下，人们知之甚少。

本项研究收集了两个跨越 20 年（1992-2019）的患者队列以及临床随访数据（图S1a）。第一个队列的 57 例样本来自 53 名患者，其中46例为初诊BCR-ABL1急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)， 5例为慢性髓系白血病(CML)，2例为混合表型急性白血病(MPAL)（图S1b）。非负矩阵分解(NMF)和一致聚类发现了三个不同的转录组聚类，最初标记为C1、C2和C3（图1a）。

他们首先使用基因集富集分析(GSEA)来检测这些转录组聚类。C1以干细胞和髓系基因（如KIT、CSF3R和MECOM）的异常表达为特征（图1b），富含与先天免疫（TNFα，炎症反应）相关的途径。C2显示髓系（CSF2RA和CSF1R）和淋巴系基因（MS4A1/CD20和IL7R）的部分表达，并富集与ERK信号通路、未折叠蛋白反应(UPR)和其他与造血无关的通路[肌发生、上皮向间质转化(EMT)]。C3表达最多的是与B细胞分化相关的基因，如IL7R、MS4A1、BACH2和TCL1A，并且在细胞周期通路（E2F靶点、G2M检查点）和B细胞受体信号通路中富集。

然后，他们将这些转录组聚类与流式细胞数据进行比较。8种抗原在集群间存在差异表达（图1c）。髓系抗原CD13、CD33和细胞质髓过氧化物酶(cyMPO)以及T细胞抗原CD7在C1中表达水平最高，而T细胞抗原CD10、CD19和CD20在C3中表达水平最高。值得注意的是，成熟的T细胞抗原CD20在C1和C2中经常缺失，但在C3中经常表达。这暗示了使用单克隆CD20抗体（如利妥昔单抗）进行靶向治疗的潜能。C1聚类中干细胞抗原CD34的表达也最高。C1经常表达髓样抗原和淋巴样抗原，而C3则表现出淋巴样抗原的限制性表达。

尽管有表面髓系抗原的表达，但cyMPO的水平低于10%的MPAL诊断阈值。然而，C1的cyMPO水平仍明显高于C2和C3（图1c）。与流式细胞分析相比，RNA-seq检测低水平MPO的动态范围更大。目前的诊断指南可能低估了混合谱系表型的BCR-ABL1淋巴细胞白血病的数量。

图S1.实验流程。

(a)主要队列的研究设计。(b)白血病母细胞和 T 细胞的荧光激活细胞分选方案示例。(c)结合非负矩阵分解(NMF)和一致层次聚类的RNA-seq聚类方法。

图1. BCR-ABL1淋巴细胞白血病的三种分子亚型。

(a) 通过共识层次聚类鉴定的BCR-ABL1淋巴细胞白血病中三种分子亚型的基因表达热图。 (b) 干细胞/骨髓细胞和 B 淋巴细胞程序中所选差异表达基因的热图。 (c) 按亚型划分的髓系（上）和 B 淋巴系（下）谱系抗原呈阳性的母细胞的比例。

他们将转录组聚类与人类脐带血中的正常对应物进行比较，包括 HSC、多能祖细胞 (MPP)、骨髓祖细胞[共同骨髓祖细胞 (CMP)、巨核细胞-红系祖细胞 (MEP)、粒细胞/巨噬细胞祖细胞 (GMP)]和八种不同的淋巴细胞和B细胞祖细胞[淋巴激活MPP(LMPP)、多淋巴细胞祖细胞(MLP)、早期pro-B、pro-B、pre-B I、pre-B II、未成熟B和成熟B细胞]。主成分分析(PCA)显示，C1白血病与早期前体B细胞密切相关（图2a），尽管它们具有很强的干细胞/髓系基因表达模式。早期的前体B细胞是B细胞发育的第一步，并保留髓系和T淋巴系的潜能。为了进一步描述C2和C3白血病的分化程度，他们评估了免疫球蛋白重链和轻链的表达。重排重链(IGH)的表达在所有聚类中相似，而重排轻链（IGK或IGL）的表达在C3中最常见（图2b）。C3白血病也表现出B细胞转录因子EBF1和PAX5以及B细胞受体信号基因的显著上调（图2c-d）。这表明C3的分化阻滞较C2晚。这些结果证明C1, C2和C3白血病在早期B细胞发育的不同阶段发生阻断。总之，他们标记的转录组亚型如下：C1，早期B细胞祖细胞('early - pro')；C2：中间B细胞祖细胞(Inter-Pro)；C3：晚期B细胞祖细胞('late - pro') （图2e）。

然后，他们进行了单细胞转录组分析(scRNA-seq)，在4个Late-Pro样本中，95.3%的白血病细胞分配为pro-B细胞或pre-B I细胞（图2f）。Inter-Pro样本显示对pro-B细胞和pre-B I细胞的分配减少，对早期pro-B细胞的分配增加，分化阻滞更早。与Inter-Pro和Late-Pro样本相比，Early-Pro样本显示出更多的谱系异质性（图2g）。

图2. 分子亚型停滞在 B 细胞分化的不同阶段。

(a) 主成分分析(PCA)。 (b) 克隆重排免疫球蛋白轻链基因(IGK、IGL)表达和不表达的各亚型白血病的比例。(c) B细胞发育基因EBF1和PAX5按亚型归一化计数。 (d) B细胞受体信号转导的基因集评分。(e) 与B细胞分化阶段相关的分子亚型的大致定位。 (f) 来自scRNA-seq的单细胞与最接近的正常细胞对应物进行注释，并使用UMAP进行可视化。 (g) 每个亚型中细胞类型注释的比例。

对第一队列中的57例患者进行全基因组测序(WGS)。发现了已知的复发性亚型如IKZF1(77%)、PAX5(42%)、CDKN2A/B(38%)、SLX4IP(25%)、HBS1L(23%)、BTG1(19%)、RB1(15%)、EBF1(15%)、MEF2C(15%)、RUNX1(15%)（图3e）。在转录组亚型中，EBF1的改变仅限于早期白血病（图3a）。在B细胞参与的初始阶段，EBF1抑制髓系和T细胞谱系，在早期白血病中发现，EBF1的缺失会抑制这些谱系程序。

尽管在所有转录组亚型中都存在IKZF1改变，但在Inter-Pro白血病中双等位基因损失显著增加（图3a）。Inter-Pro白血病也因IKZF1的显性Ik6的缺失而富集，IKZF1缺乏DNA结合域。IKZF1的失活激活了基质基因，因此，Inter-Pro样品中这些基因的异常表达显著富集。

重组激活基因(RAG)内切酶(RAG1/2)在淋巴祖细胞V(D)J重组过程中，在称为重组信号序列(RSS)的特定基序上引入DNA双链断裂。在抗原受体基因外的结构变异(SV)上存在RSS基序表明脱靶RAG活性，这在淋巴性白血病中很常见。这些SV中有19%与BCR-ABL1易位相关，其余81%与协同事件相关（例如IKZF1、PAX5和CDKN2A/B的缺失）（图3b）。与BCR-ABL1易位相关的SV相比，RSS基序中与合作事件相关的SV显著富集（图3c-e）。只有与协同事件相关的SV断点频率随与RSS基序距离的减小而减小（图3f）。有趣的是，SLX4IP缺失的白血病中含有更多的RAG介导的SV（图3g）。

图3. 不同的协同遗传改变定义了每种分子亚型。

(a) 每个亚型中丰富的基因改变的Oncoprint。 (b) 反复出现的IKZF1缺失（蓝线）是由RAG介导的重组产生的。 (c) 具有和不具有RSS基序的BCR-ABL1相关和转化相关(Transform.) SV的比例。 (d) 使用WebLogo生成的转换相关SV中隐式RSS七聚体的序列标识。 (e) 每个基因发生改变的白血病的频率。(f) 在转换相关的SV中，SV断点与最近的RSS基元（黑色）之间的距离形成负二项分布（灰色）。 (g) SLX4IP缺失状态下原发性白血病中RAG介导的重组数量。

他们对来自14名患者（6名Early-Pro, 2名Inter-Pro和6名Late-Pro）的造血干细胞和祖细胞(CD34 +CD19 - CD45RA -)进行了分类，并进行了克隆形成实验，该实验可以去除残留的原细胞并促进干细胞/祖细胞分化为髓细胞（图4a）。14例患者中有4例在粒细胞/巨噬细胞(GM)和红系克隆中检测到CR-ABL1易位（图4b）。4例患者有诊断和复发的配对样本。其中3例在诊断后2年内复发（图4c）。在这些患者中，大多数在诊断时存在的变异在复发时发现（图4d）。在诊断和复发之间，转录组亚型、免疫表型和抗原受体重排也保持不变（图4e）。这表明复发出现在主要的诊断克隆在这三个病人。第4例患者(Ph53)在缓解4年后复发。虽然相同的BCR-ABL1易位是共有的，但只有14%的诊断性突变在复发时出现（图4d）。从RNA-seq中，诊断性白血病分类为Late-Pro，而复发性白血病分类为Early-Pro，表明转录组亚型的转换（图4e）。复发样本含有与Early-Pro亚型一致的RUNX1突变（图4g）。

图4. 多能细胞中BCR-ABL1淋巴细胞白血病的起源。

(a) B 淋巴细胞的简化谱系层次和四种克隆类型。 (b) 四名具有BCR-ABL1阳性克隆的患者样本。(c) 四对诊断和复发白血病患者的临床事件时间表。(d) 基于点突变的四个白血病对的系统发育关系。(e) 使用 NMF 成分基因对白血病转录组进行 PCA。(f) PAX5失活（框）和单体 7 是 Ph53-D 专有的。红色和蓝色部分分别表示拷贝数的增加和缺失。(g) RUNX1突变是Ph53-R特有的。

主要分子缓解(MMR)定义为残留病灶减少≥3个对数（≤0.1%转录本）（图5a）。诱导治疗期间，Early-Pro患者和Inter-Pro患者达到MMR的患者明显少于Late-Pro患者。Early-Pro、Inter-Pro和Late-Pro患者诱导治疗后的中位对数减少分别为1.4、2.2和3.5（图5b）。深度分子学缓解(DMR)（定义为降幅≥4个对数）是结局良好的预测因素，仅限于Late-Pro患者（图5b）。因此，Late-Pro亚型的总生存率(OS)和无事件生存率(EFS)明显更高（图5c）。Late-Pro患者的OS率为73%，与低风险B-ALL患者相似。引人注目的是，HBS1L的缺失是早期白血病独有的（图3a），与极差的预后相关。Early-Pro患者仅接受伊马替尼治疗，与改用第二代或第三代TKI治疗的患者相比，预后明显较差（图5d）。使用多变量Cox相互作用比例风险模型，Inter-Pro和Early-Pro亚型在使用第二代或第三代TKI治疗时，风险比(HR)显著降低（图5e）。

图5. 分子亚型预测治疗反应和结果。

(a) 每个亚型的BCR-ABL1转录物水平对数减少的残留疾病图。 (b) 诱导治疗后（诊断后最多60天）的首对数降低水平按亚型（20例Early-Pro, 12例Inter-Pro和25例Late-Pro患者）区分。 (c-d)生存分析。(e) 多变量Cox比例风险模型。

激酶结构域突变导致了本项队列中的治疗耐药性和生存率低下，尤其是早Early-Pro 白血病患者（图5a）。晚期前白血病的细胞周期相关程序富集。相比之下，细胞静止基因组在早前期白血病中显著富集（图6a-b）。在scRNA-seq数据中，Late-Pro白血病包含更多的G1/S和G2/M期细胞，而Early-Pro白血病和Inter-Pro白血病（图6c-d）。

除了细胞静止，早期白血病也富含BCR-ABL1信号及其下游靶点STAT5（图6e-f），免疫检测证实在Early-Pro样品中STAT5有较高的磷酸化。相比之下，Inter-Pro白血病表现出UPR和ERK信号通路的显著上调（图6e）。

图6. 独立于激酶结构域的治疗抵抗机制。

(a) 细胞静止和细胞周期基因集的平均基因表达热图。(b) Early-Pro 亚型中细胞静止基因集的富集。 (c) 单细胞中G 1 /S和G 2 /M期基因组的表达。 (d) 每个样品中按亚型分类的循环细胞（非G 0期）的比例。 (e) 各种信号基因集的平均基因表达热图。(f) Early-Pro 亚型中BCR-ABL1信号传导和 IL2/STAT5 信号传导基因集的富集。

本项研究发现了BCR-ABL1淋巴细胞白血病的三种转录组亚型，每种亚型都代表 B 细胞祖细胞分化阶段的成熟停滞。每次成熟停滞都以控制 B 细胞发育中不同转变点的特定基因组事件为标志。有趣的是，无论亚型如何，从患者体内分离的BCR-ABL1 +白血病前期干细胞中均不存在这些事件，这证明转录组表型是在白血病起始事件下游确定的。

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