文献解读|Cell Rep Med（11.7）：呼吸道微生物群与 RSV 感染的严重程度和儿童症状的持续性有关

呼吸道合胞病毒 (RSV) 是婴儿下呼吸道感染和住院的最常见原因。已知的严重感染风险因素包括早产、先天性心脏病和支气管肺发育不良。然而，即使是足月出生的健康婴儿，RSV感染也会导致严重疾病，需要入住儿科重症监护病房，并可能导致长期健康后果。RSV的严重程度在普通感冒和伴有呼吸衰竭的严重细支气管炎之间变化，这表明其他宿主因素或环境因素可能会调节疾病的严重程度。多项研究发现，早期呼吸道微生物群落组成与随后（护理人员报告的）呼吸道感染风险之间存在联系。到目前为止，尚不清楚早期微生物群是否与 RSV 感染的严重程度有特定联系。

研究团队分析了在五个国家执行的两项 RESCEU 研究中从 1135 名婴儿采集的 1537 个鼻咽样本。研究纳入情况之前已经公布。对于病例对照研究，他们纳入了出生后第一年感染 RSV 并在家庭护理机构或急诊室出现症状的婴儿。此外，还纳入了一组健康婴儿。对于出生队列研究，他们在一个积极随访的嵌套队列中跟踪了婴儿出生第一年，如果他们在 RSV 季节出现呼吸道症状，则对他们进行 RSV 检测。这些研究于 2017 年至 2020 年期间在 5 个国家进行。从出生队列中纳入了 797 名婴儿（996 个样本），从病例对照研究中纳入了 257 个 RSV 病例（489 个样本）和 52 个健康对照（52 个样本）并进行微生物组学分析（图1）。

首先，他们研究了 RSV 感染期间和 RSV 恢复期的微生物群概况，并将它们与健康对照的概况进行了比较。在 RSV 感染期间，健康对照者和婴儿样本之间的 alpha 多样性没有显著差异（图 2 A）。然而，与健康对照相比，恢复期的 alpha 多样性 (Shannon) 较低。对于后一种分析，当将 RSV 和恢复期之间的时间作为协变量时，结果仍然相似。比较各组间观察到的扩增子序列变异 (ASV) 数量（丰富度）时发现，与 RSV 感染期间相比，恢复期的丰富度较低。相反，与 RSV 感染相比，恢复期的细菌密度更高。

使用主坐标分析 (PCoA)，他们发现对照样本、RSV 样本和恢复期样本之间整体微生物群落组成存在明显差异。他们评估了健康状况与整体微生物群落之间的关联，同时调整了样本采集时的年龄和性别，结果显示急性 RSV 和恢复期样本与健康对照有显著差异。此外，他们发现恢复期采集的样本与急性 RSV 不同（图2B），当他们将感染和恢复期之间的时间纳入模型时或限制受试者内的排列，这一差异仍然显著。

为了定义样本中的聚类或概况类型，他们对整个数据集应用了无监督的完全链接层次聚类，将具有相似微生物群概况的样本归类在一起，从而形成微生物群聚类。样本主要聚类在以莫拉氏菌(2) 为主导的聚类 (MOR2)（病例对照研究），其次是嗜血杆菌(8) (HAE8)、棒状杆菌(3) 加Dolosigranulum (4) (CDGa/b) 和以链球菌(6) 为主导的聚类（图 2 C）。注释为链球菌(6) 的ASV与S. (pseudo)pneumoniae分离株 (BLASTn) 的序列相似性为 100% ，表明该 ASV 代表肺炎球菌（一种已知的潜在病原体）。敏感性分析仅使用每个受试者的单个样本，结果显示与基于完整数据集的聚类高度一致，96.2% 的样本分配到相同的聚类中。

使用逻辑混合效应回归分析（包括聚类、年龄和性别作为固定效应，研究地点作为随机效应），与 CDGa/b 聚类相比， HAE8、STR6 和 MOR2 聚类与 RSV 感染相关（调整后的优势比 [aOR] 分别为 6.1、9.1 和 2.52，所有p < 0.02）（图 2D）。较小的 HAE9 聚类甚至是病例中唯一观察到的。在恢复期也发现了类似但不太明显的聚类分布，虽然与肺炎链球菌/STR6 聚类的关联消失了，这表明该聚类与感染的急性期更紧密相关。

属水平的差异丰度分析（MaAsLin2）在很大程度上证实了基于聚类的分析，其中嗜血杆菌属的相对丰度较高（根据年龄、性别和研究地点调整[随机效应]），而RSV感染期间棒状杆菌和Dolosigranulum属的丰度较低。有趣的是，与健康对照组相比，莫拉氏菌属在RSV恢复期更为富集（图2E-F）。这些结果表明病毒感染、炎症和/或（抗生素）治疗对细菌微生物群具有长期影响。

接下来，他们根据严重程度对 RSV 感染进行分层，例如轻度、中度和重度。虽然严重程度组和健康对照组之间的 α 多样性或细菌密度没有差异（图 3 A），但他们发现整体微生物群落组成存在很大差异。PCoA 可视化表明，随着严重程度的增加，与健康的偏差变得更大（图 3 B）。事实上，微生物群落变异比例的逐步增加可能与疾病严重程度有关。此外，当比较呼吸道合胞病毒感染期间的社区与恢复期的群落时，重症呼吸道合胞病毒病例的个体内微生物“差异”明显高于轻度疾病患者（图 3 C）。

与之前的分析一致，聚类成员和差异丰度分析表明，随着 RSV 感染严重程度的增加，与健康的偏差也随之增加。特别是在重症 RSV 病例中，STR6（可能是肺炎链球菌）、HAE8 和 STR4 聚类更加富集（图 3D）。差异丰度分析证实，随着 RSV 疾病严重程度的增加，与健康相关的微生物（包括棒状杆菌和Dolosigranulum spp.）的耗竭变得更加严重（图3E-F）。

此外，他们想试图探究是否可以在 RSV 恢复期检测到“微生物疤痕”，推测在病情更严重后，残留的微生物偏差会更加极端。使用 ASV 水平差异丰度分析 (MaAsLin2)，他们发现对这一假设的支持有限，只有几种罕见的棒状杆菌属与之前的严重 RSV 感染有关。在校正感染期间使用抗生素后，这些差异不再显著。他们还检测了恢复期的症状（鼻塞/咳嗽/喘息）是否与剩余的微生物群扰动有关。呼吸道症状的持续与嗜血杆菌的相对丰富度较高和Dolosigranulum的缺乏有关（图4A-B）。

最后，他们决定评估生命早期微生物群落发育是否与连续的呼吸道合胞病毒易感性和严重程度有关。首先对出生队列参与者在出生最初 11 天的微生物群进行了表征。在评估 ASV 水平的 alpha 多样性时，他们发现取样年龄与微生物多样性之间存在负对数线性关系（图 5 A），表明在出生后的最初 12 天内，alpha 多样性随着年龄的增长而降低。相反，细菌密度与年龄呈正对数线性关系。

接下来，他们评估了整体微生物群落组成，再次显示年龄类别对微生物群组成有显著影响（图 5B）。排除从西班牙婴儿采集的样本，由于他们通常年龄较小（因此无法在本研究的模型中对采样日期和研究地点进行适当的校正），他们仍然可以检测到显着的年龄效应，证实这种影响不是由研究地点之间的差异造成的。除年龄外，其他临床因素也与整体微生物群落组成的差异有关。使用双变量 PERMANOVA 检验（根据年龄类别进行调整并在适当情况下限制研究地点内的排列），他们发现研究地点对整体微生物群落组成有较大影响，分娩方式和兄弟姐妹对整体微生物群落组成有适度但显著的影响。出生季节、性别或喂养方式没有显著影响。

使用 PCoA，他们发现 <5 天婴儿样本与 ≥5 天婴儿样本之间的分离特别明显（图 5 B）。总体而言，在基线时，他们主要观察到以葡萄球菌(1) (STA1)、STR4、CDGa/b和 MOR2为特征的聚类。与年龄较大的婴儿相比，STR4 聚类成员在 <5 天的婴儿中更为普遍，而 STA1 和 CDG 聚类在年龄较大的儿童中富集（图 5 C）。虽然总体上不太普遍，但 MOR2 聚类成员在出生后 5 天以上的儿童中更为常见。

他们假设早期微生物群落特征可以预测出生第一年内连续 RSV 感染的严重程度。在这项分析中，他们仅纳入了出生第一年内确诊为 RSV 感染的婴儿的基线微生物群特征。由于这些 RSV 感染通常较轻（RESViNet 评分 0-7），他们将就医视为区分病情较重和较不严重的一种指标。接受医疗护理的 RSV 感染婴儿与未接受医疗护理的 RSV 感染婴儿相比年龄较小。因此，他们在所有下游分析中都校正了 RSV 感染时的年龄。调整取样年龄、RSV 感染年龄、性别、出生季节和研究地点（置换区组）后，整体基线微生物群落组成与疾病严重程度呈显著相关趋势。基线微生物群落与连续的 RSV 严重程度更明显相关，在接受医学治疗的 RSV 感染婴儿中，MOR2 群落发生率较低（与 CDG 相比）（图 5 D）。

为了进一步量化基线微生物群特征与 RSV 感染（大多为轻度）严重程度之间的关联，他们拟合了一个随机森林分类模型，其中 39 种微生物特征作为“预测因子”，包括 RSV 感染时的年龄作为协变量，并将是否就医作为结果。模型调整后，他们发现曲线下面积 (AUC) 仅为 0.59（95% CI 0.49–0.69），基于 5 倍交叉验证预测的结果相似（图 5 E）。计算了表示对模型输出影响的 Shapley 加性解释 (SHAP) 值以评估变量重要性。平均绝对 SHAP 值表明，与先前的研究结果一致，Dolosigranulum pigrum (5) 在区分需要就医和未就医的 RSV 时最为重要，其次是葡萄球菌(1)。首次感染 RSV 的年龄虽然与就医有关，但仅显示出中等重要性（图5F-G）。总体而言，该分类模型根据基线微生物组初步且适度地区分了 RSV 期间需要就医和未需要就医的情况，但应该注意的是，该队列中大多缺乏重症病例。总之，这些发现表明，出生第一年内感染呼吸道合胞病毒是随机的，尽管严重程度可能与生命早期的呼吸道微生物群略有相关。

为了研究呼吸道微生物群与 RSV 感染之间的关系，本研究对来自一个出生队列和一项儿科病例对照研究（欧洲呼吸道合胞病毒联盟 [RESCEU]）的鼻咽样本进行了微生物组分析。在出生后不久（“基线”）、RSV 感染和恢复期以及健康对照者中采集了 1537 个样本，发现基线微生物群与连续 RSV 感染的严重程度之间存在潜在关联。感染 RSV 的婴儿和对照婴儿在感染期间的呼吸道微生物群明显不同。嗜血杆菌、链球菌和莫拉氏菌的丰度与严重疾病和症状持续有关，而Dolosigranulum和棒状杆菌丰度的逐步增加与较轻的疾病和健康状况有关。新生儿呼吸道微生物群与出生第一年内的 RSV 严重程度仅有适度关联。然而，感染时的呼吸道微生物群与疾病的严重程度和残留症状密切相关。