文献解读|Nat Genet（31.7）：多组学分析突出了与非小细胞肺癌免疫化疗耐药性相关的因素

免疫检查点阻断 (ICB) 治疗彻底改变了非小细胞肺癌 (NSCLC) 的治疗，甚至治愈了一些晚期患者。新辅助免疫化疗比单独使用 ICB 更有效，平均缓解率为 32%。许多NSCLC患者仍然对新辅助免疫化疗具有耐药性，这种耐药性背后的分子机制仍不清楚。

为了揭示ICB-化疗前后NSCLC的变化，研究团队采用scRNA-seq对19例NSCLC患者在抗PD-1和化疗新辅助治疗前后的26个肿瘤样本进行了分析（图1a-b）。根据病理学评估，该评估在评估ICB-化疗治疗效果和预测生存率方面是可靠的，将六名患者归类为应答者[其中五名患者病理完全缓解(pCR)，一名患者病理主要缓解(MPR)]，其余13名患者为无应答者[表现出非主要病理缓解(NMPR)]（图1b）。三名应答者和四名无应答者的治疗前后肿瘤标本相匹配（图1b）。经过质量控制后，他们获得了 232080 个单细胞的转录组，平均每个细胞捕获 2645 个读数和 1205 个基因。他们进行了无监督聚类分析以解析细胞组成，并使用典型的细胞类型特异性标记进行细胞类型注释（图1c-d）。

他们获得了 64947 个上皮细胞，它们形成了两个不同的主要聚类（图1c），大概代表具有不同转录组特征的正常细胞和恶性细胞。为了更好地表征上皮细胞的异质性，他们对这些细胞进行了重新聚类。他们使用 InferCNV 平台根据它们的拷贝数变异(CNV)分离正常细胞和恶性细胞（图1e）。无监督分析确定了 21 个上皮亚聚类：八个具有不同标志物的正常亚聚类和 13 个恶性亚聚类。在上皮细胞区室中，ICB 化疗后应答者的恶性细胞基本上消除（图1e），他们还观察到免疫和基质区室内的改变。在免疫细胞区室中，治疗后无应答患者的单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞比例与治疗前水平相比有所增加（图1f）。此外，在 CD31 −基质细胞区室中，无论是在基线还是治疗后，无应答患者的 XI 型胶原蛋白 α 1 链阳性 (COL11A1+) 癌症相关成纤维细胞 (CAF) 比例均显著高于应答患者（图1g）。这些结果表明此类细胞在影响 ICB 化疗反应性方面可能发挥作用。虽然scRNA-seq 为 NSCLC TME 的细胞组成提供了有价值的见解，但它缺乏有关肿瘤内细胞空间分布的信息。因此，他们分别使用 GeoMx 数字空间剖析器 (DSP) 平台和 10x Genomics Visium 平台对 14 例未治疗标本和 17 例治疗后标本进行了空间转录组分析（图1b-i），发现了众多异质性特征。

肿瘤中的转录异质性是支持肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药性的基础。最近的研究已将基因模块确定为定义细胞状态的关键特征。利用 scRNA-seq 数据，他们最初分享了癌细胞的细胞状态。通过 Harmony，他们将这些细胞分为 14 个子集，并通过基因集富集分析对它们进行注释，其中标记物表达水平较高（图2a-b）。细胞状态聚类为两组：一组包括干扰素 (IFN)、肺泡、雌激素、细胞外基质和凝血细胞状态，另一组包括鳞状、核因子红细胞2相关因子2 (NRF2) 靶标和细胞周期相关细胞状态（图2c）。这两组中的癌细胞状态评分呈强烈的负相关性（图2c）。一些癌细胞状态评分（例如，缺氧、鳞状、细胞周期、E2F 靶标、NRF2 靶标和 Myc 靶标评分）与来自癌症基因组图谱肺腺癌 (TCGA-LUAD) 队列的患者生存率低有关（图 2d）。相反，包括凝血、肺泡、细胞外基质、雌激素和 IFN 在内的癌细胞状态与延长生存期有关。

为了研究癌细胞状态在治疗中的作用，他们使用 scRNA-seq 数据比较了免疫治疗期间癌细胞的细胞状态评分。治疗前无应答者的 NRF2 靶标评分明显高于治疗前应答者，而 IFNγ 评分则呈现相反的趋势（图2e）。这表明癌细胞的生物学特征可能影响免疫治疗的临床结果。利用 DSP 数据，他们检测了治疗前的肿瘤细胞状态。与细胞状态评分类似，IFNγ 和 NRF2 靶标的相关基因在应答者和无应答者中分别显著富集（图2f-g）。他们进一步探索了这两种细胞状态与其他细胞类型之间的空间关系（图2h）。IFNγ 评分与相邻免疫细胞比例呈正相关，而 NRF2 靶标评分呈负相关（图2h-i）。这表明癌细胞状态在塑造多样化肿瘤微环境(TME)方面发挥着潜在作用。

为了研究细胞成分的空间组织和相互作用，他们使用 Visium 数据对治疗后的 TME 进行了分类。根据苏木精和伊红 (H&E) 染色和先前研究中对肿瘤区室的定义，将肿瘤分为四个不同的区域：肿瘤核心、侵袭性边缘、孤立肿瘤和肿瘤基质区域（图3a）。由于 Visium 载玻片上的每个点代表多种细胞的混合物，他们使用 STRIDE 23基于匹配的 scRNA-seq 数据执行细胞类型反卷积分析。与 H&E 图像一致，肿瘤核心主要由恶性细胞占据，而侵袭性边缘和孤立肿瘤同时包含恶性细胞和非恶性细胞，在肿瘤基质区域几乎没有可见的恶性细胞 （图3a）。基于细胞类型组成对所有空间转录组学点进行无监督聚类，他们确定了 15 种不同的细胞类型环境（编号0-14）（图3b）。他们假设这些环境代表了可以在患者之间共有的潜在空间架构，从而有助于在不同样本之间进行比较。他们观察到三种恶性肿瘤相关细胞类型环境（3、10 和 13）和两种成纤维细胞类型环境[4:富集乙醇脱氢酶 1B 阳性 (ADH1B+) CAF]和8:富集COL11A1+ CAF)]，以及四种免疫细胞类型环境（1、7、9 和 12）（图3c-d）。

空间可视化揭示了它们的位置关系和与空间结构的相关性。例如，恶性肿瘤相关环境 3 和 13 由成纤维细胞环境8 包围，这意味着肿瘤细胞与肿瘤边界处的成纤维细胞相互作用（图3e）。此外，富含生发中心 B 细胞和 CD4+ CXCL13 + T 细胞的细胞类型环境 9 的位置与淋巴细胞聚集的位置相对应（图3e）。

他们比较了治疗前应答者和无应答者肿瘤边界的细胞比例。无应答者的 CD8 + T 细胞比例低于应答者，而 COL11A1 + CAF比例高于应答者（图4a）。因此，他们假设肿瘤边界的 COL11A1 + CAF可能阻止了 T 细胞的浸润。他们进一步探讨了肿瘤标本中 COL11A1 + CAF 和 ADH1B + CAF的空间分布。有趣的是，COL11A1 + CAF聚集在孤立肿瘤的边界，但在无应答者中远离恶性细胞的基质区域急剧减少（图4b）。在肿瘤核心区域和侵袭性边缘，肿瘤由COL11A1+ CAF包围（图4c-d）。同时，这些 COL11A1 + CAF 在应答者和无应答者的肿瘤基质区域几乎不存在。相反，ADH1B + CAF在肿瘤基质区域富集，但在孤立的肿瘤边界上不存在（图4b-d）。始终如一的是，肿瘤核心区域几乎没有任何 ADH1B + CAF（图4c）。然而，ADH1B + CAF在肿瘤基质载玻片中占主导地位。

COL11A1+CAF与癌细胞之间的空间关系表明它们存在潜在的细胞间相互作用。因此，他们进行了细胞间相互作用分析以确定潜在的相互作用。在肿瘤细胞和 COL11A1⁺ CAF 之间观察到盘状结构域受体 1 (DDR1) 与胶原蛋白（COL1A1、COL3A1、COL5A2 和 COL11A1）之间的受体-配体相互作用（图4e）。鉴于 COL11A1 表达特定于 COL11A1+ CAF，他们主要关注 DDR1-COL11A1 共定位以进行进一步分析。据报道，肿瘤中 DDR1 的细胞外结构域可促进胶原纤维排列并阻碍免疫细胞浸润。此外，DDR1-COL11A1 的共定位水平以及胶原形成特征在肿瘤边界高度富集，而在远离癌症的区域则下降（图4b）。免疫荧光标记也证实了 ICB 化疗后，COL11A1+ CAF 位于 NSCLC 中的 DDR1+恶性细胞周围（图4f）。

为了探究 COL11A1+CAF是否阻碍免疫细胞浸润，他们分析了 COL11A1+CAF与 T 细胞之间的关联。观察到含有恶性细胞的斑点周围的 COL11A1+CAF丰度与所有含有恶性细胞的样本中的 T 细胞丰度呈显著负相关（图4g）。同时，他们发现 T 细胞浸润也与未接受治疗的队列中的 COL11A1+CAF丰度呈负相关（图4h）。

他们进一步评估了 COL11A1+CAF的丰度是否可以作为 NSCLC 预后的可靠预后因素。接受 ICB 治疗的队列的风险比高于未接受治疗和化疗的队列（图 4i），这表明 COL11A1+ CAFs 可能在 ICB 治疗队列中发挥更重要的作用。为了进一步验证 COL11A1+ CAF的丰度是否可以预测对 ICB 治疗的反应性，他们分析了另外两个独立队列。在 ICB 治疗之前，无应答者的 COL11A1+ CAF 比例再次明显高于应答者（图4j-k）。有趣的是，即使在黑色素瘤队列中，他们也观察到了类似的趋势（图4l）。总之，上述分析表明，COL11A1+CAF可能是预测预后和 ICB 治疗反应的有效生物标志物。

先前的研究表明，CAF-巨噬细胞相互作用促进结肠癌和肝癌中的肿瘤生长。因此，他们探讨了 NSCLC 中巨噬细胞与 COL11A1 + CAF 之间的关系。他们在 scRNA-seq 数据中观察到 COL11A1+ CAF 的丰度与分泌型磷蛋白 1 阳性 (SPP1+) 巨噬细胞的丰度之间存在正相关性（图5a）。与 COL11A1+CAF的结果一致（图1g），治疗前后无应答者的 SPP1+巨噬细胞比例也显著较高（图5b）。与 COL11A1 + CAF 一样，SPP1+巨噬细胞也在肿瘤边界聚集，在远离癌症的基质区域丰度较低且分布分散（图5c-e）。通过 SPP1+巨噬细胞和 COL11A1+CAF之间的细胞-细胞相互作用，他们注意到 SPP1-CD44 对的富集（图5f）。巨噬细胞分泌的 SPP1 促进 CAF的增殖和活化，并增加胶原蛋白的沉积。有趣的是，与 COL11A1 + CAF-high区域相比，T 细胞浸润水平较高的 COL11A1+ CAF-low 区域的 SPP1-CD44 共定位水平也明显较低（图5g-i）。这表明 SPP1 +巨噬细胞可能与 COL11A1 + CAF协同作用，保护肿瘤免受 T 细胞浸润。在 TCGA-LUAD 队列中，COL11A1+ CAF和 SPP1+巨噬细胞水平均较高的患者生存率始终最差（图5j）。

此外，多重免疫组织化学染色显示 SPP1+巨噬细胞（以 SPP1 标记）倾向于与 COL11A1+ CAF（以 α 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 和成纤维细胞活化蛋白标记）一起定位在肿瘤边界，而 T 细胞（以 CD3 标记）由这两种细胞类型的组合阻断（图5k）。此外，在 COL11A1+ CAF存在的情况下，CXCL9+巨噬细胞和细胞毒性免疫细胞无法进入肿瘤床。

总之，这些结果表明与 SPP1+巨噬细胞和 COL11A1+CAF相关的肿瘤边界结构的形成可能有助于 NSCLC 的免疫抑制微环境。

COL11A1+CAF与癌细胞之间的空间关系表明它们存在潜在的细胞间相互作用。因此，他们进行了细胞间相互作用分析以确定潜在的相互作用。在肿瘤细胞和 COL11A1⁺ CAF 之间观察到盘状结构域受体 1 (DDR1) 与胶原蛋白（COL1A1、COL3A1、COL5A2 和 COL11A1）之间的受体-配体相互作用（图4e）。鉴于 COL11A1 表达特定于 COL11A1+ CAF，他们主要关注 DDR1-COL11A1 共定位以进行进一步分析。据报道，肿瘤中 DDR1 的细胞外结构域可促进胶原纤维排列并阻碍免疫细胞浸润。此外，DDR1-COL11A1 的共定位水平以及胶原形成特征在肿瘤边界高度富集，而在远离癌症的区域则下降（图4b）。免疫荧光标记也证实了 ICB 化疗后，COL11A1+ CAF 位于 NSCLC 中的 DDR1+恶性细胞周围（图4f）。

为了探究 COL11A1+CAF是否阻碍免疫细胞浸润，他们分析了 COL11A1+CAF与 T 细胞之间的关联。观察到含有恶性细胞的斑点周围的 COL11A1+CAF丰度与所有含有恶性细胞的样本中的 T 细胞丰度呈显著负相关（图4g）。同时，他们发现 T 细胞浸润也与未接受治疗的队列中的 COL11A1+CAF丰度呈负相关（图4h）。

他们进一步评估了 COL11A1+CAF的丰度是否可以作为 NSCLC 预后的可靠预后因素。接受 ICB 治疗的队列的风险比高于未接受治疗和化疗的队列（图 4i），这表明 COL11A1+ CAFs 可能在 ICB 治疗队列中发挥更重要的作用。为了进一步验证 COL11A1+ CAF的丰度是否可以预测对 ICB 治疗的反应性，他们分析了另外两个独立队列。在 ICB 治疗之前，无应答者的 COL11A1+ CAF 比例再次明显高于应答者（图4j-k）。有趣的是，即使在黑色素瘤队列中，他们也观察到了类似的趋势（图4l）。总之，上述分析表明，COL11A1+CAF可能是预测预后和 ICB 治疗反应的有效生物标志物。

免疫检查点阻断化疗后，TLS 在 NSCLC 的 TME 中普遍存在。多项研究报告称，TME 中的 TLS 遵循连续的成熟阶段。TLS是从局部产生细胞因子（如白细胞介素 7）开始的，这些细胞因子将淋巴组织诱导 (LTi) 细胞募集到炎症部位。然后，LTi 细胞通过淋巴毒素 α1β2-LTβ 受体信号通路与基质细胞相互作用，从而启动TLS的形成。有趣的是，尽管大多数样本中都存在 TLS，但仅在少数载玻片中检测到 LTβ-LTβ 受体信号的空间分布。因此，他们推测不同样本中 TLS 的明显异质性可能反映了 TLS 的不同成熟阶段。为了全面表征 TLS 的成熟过程，他们收集了所有样本的 TLS 并将它们投影到同一低维空间上（图6a）。编码 TLS 起始标记（RORC和IL7R）的基因确实在相似的分布中富集，而编码功能性细胞因子（LTB和CXCL13）的基因在 TLS 的不同亚群中富集（图6b）。使用K均值聚类来区分 TLS 的不同成熟阶段（图6c），其中包括早期淋巴聚集体（以 LTi 标记高表达和低细胞因子表达为特征）、活化 TLS（高细胞因子表达）、衰退 TLS（细胞因子表达降低）和晚期 TLS（非常低的细胞因子表达）（图6c）。

他们进一步研究了TLS在不同阶段的免疫细胞亚型组成（图6d）。这些结果共同表明，生发中心B细胞、效应记忆CD4 T细胞和滤泡辅助T细胞对TLS的激活和功能至关重要，而记忆B细胞与TLS的长期影响更相关。为了探索 TLS 成熟与 ICB-化疗反应性之间的关系，他们将每个标本中不同状态下 TLS 的分布可视化。成熟阶段在患者之间表现出显著的多样性，甚至在同一载玻片内也存在差异（图6e-f）。在无应答者中，免疫治疗后残留肿瘤负荷减少，检测到更多 TLS 的趋势意味着 TLS 具有潜在的抗肿瘤作用（图6e）。在非 pCR 组中，具有激活 TLS 的患者残留肿瘤分数较低（图6g），表明激活 TLS 与更好的预后相关。令人惊讶的是，与无应答者相比，pCR 患者的 TLS 较少，而且几乎所有都处于晚期（图6e）。这些发现可能表明应答者的 TME 中存在免疫应答衰退的状态。此外，不同成熟状态的 TLS 表现出不同的位置偏向。具体来说，大多数肿瘤内TLS属于早期淋巴聚集状态，而衰退性TLS与激活的TLS相比更接近残留肿瘤细胞（图6f），这意味着肿瘤细胞附近可能存在免疫抑制环境。

他们进一步研究了TLS在不同阶段的免疫细胞亚型组成（图6d）。这些结果共同表明，生发中心B细胞、效应记忆CD4 T细胞和滤泡辅助T细胞对TLS的激活和功能至关重要，而记忆B细胞与TLS的长期影响更相关。

为了探索 TLS 成熟与 ICB-化疗反应性之间的关系，他们将每个标本中不同状态下 TLS 的分布可视化。成熟阶段在患者之间表现出显著的多样性，甚至在同一载玻片内也存在差异（图6e-f）。在无应答者中，免疫治疗后残留肿瘤负荷减少，检测到更多 TLS 的趋势意味着 TLS 具有潜在的抗肿瘤作用（图6e）。在非 pCR 组中，具有激活 TLS 的患者残留肿瘤分数较低（图6g），表明激活 TLS 与更好的预后相关。令人惊讶的是，与无应答者相比，pCR 患者的 TLS 较少，而且几乎所有都处于晚期（图6e）。这些发现可能表明应答者的 TME 中存在免疫反应衰退的状态。此外，不同成熟状态的 TLS 表现出不同的位置偏向。具体来说，大多数肿瘤内TLS属于早期淋巴聚集状态，而衰退性TLS与激活的TLS相比更接近残留肿瘤细胞（图6f），这意味着肿瘤细胞附近可能存在免疫抑制环境。

上述分析表明，不同应答患者的 TLS 成熟状态存在高度异质性。他们进一步研究了同一状态下应答者和无应答者的 TLS 之间的差异。鉴于在 pCR 患者中观察到的几乎所有 TLS 都处于晚期阶段，他们对 pCR 和 NMPR 患者的晚期 TLS 进行了差异表达分析。与应答者相比，无应答者的晚期 TLS 表达更高水平的HIF1A和ENO1，据报道它们分别参与对缺氧的反应和糖酵解过程（图6h）。此外，编码热休克蛋白的基因，如HSP90B1和HSP90AA1，在无应答者的晚期 TLS 中高度表达（图6h）。考虑到热休克蛋白通常在不同的应激条件下上调，包括缺氧，他们推测无应答患者的晚期 TLS 处于缺氧环境下。进一步的功能分析表明，与糖酵解和缺氧反应相关的途径在无应答患者的晚期 TLS 中也富集（图6i）。有趣的是，在 pCR 患者的晚期 TLS 中未发现高表达的基因（图6h），表明这些 TLS 处于衰退和静止状态。总之，这些结果表明位于缺氧 TME 中的无应答患者的晚期 TLS 可能不利于维持功能性 TLS。

有趣的是，缺氧特征评分的增加也与 ICB 化疗后无应答者的早期 TLS 有关（图6j）。先前的研究报告称，缺氧可导致 TME 中调节性 T 细胞增强，与淋巴聚集状态下调节性 T 细胞的富集一致（图6d）。另一项研究发现，缺氧可以通过抑制 CD4 效应 T 细胞来增强免疫抑制。事实上，他们观察到 TLS 中的缺氧特征评分与调节性 T 细胞的比例呈正相关，与效应记忆 CD4+T 细胞呈负相关。因此，他们推测缺氧可能产生免疫抑制性 TME，从而抑制 TLS 活化。为了检验这一点，他们分析了另一个 NSCLC 队列中缺氧评分与 TLS 活化评分之间的相关性。这两个评分之间的总体负相关性意味着缺氧TME可能对TLS形成产生抑制作用（图6k）。总之，这些结果表明缺氧TME可以促进调节性T细胞浸润并抑制CD4效应记忆T细胞以抑制TLS的形成和维持。

此外，他们还研究了 TLS 成熟状态作为患者生存期和对 ICB 化疗反应的预测指标的可能性。使用空间转录组学数据，将MPR 患者中的大多数 TLS 鉴定为活化的 TLS，而在非 pCR 组中，具有活化 TLS 的患者残留肿瘤百分比较低（图6e-g）。另一个独立的 NSCLC 队列也显示，在基线时应答者的活化 TLS 特征明显高于无应答者（图6l）。此外，在 TCGA-LUAD 队列患者中，较高的活化 TLS 特征与更好的总体生存率相关（图6m）。简而言之，这些结果表明活化的 TLS 对患者生存有益，并可能作为未来免疫疗法的潜在生物标志物或治疗靶点。

本研究通过分析 ICB 化疗前后 19 名患者的单细胞转录组数据和肿瘤的空间转录组数据来分析 NSCLC TME的肿瘤细胞状态和空间细胞组成，本研究发现肿瘤细胞和分泌性磷蛋白 1 阳性巨噬细胞与 XI 型胶原蛋白 α 1 链阳性癌症相关成纤维细胞相互作用，刺激胶原纤维在肿瘤边界沉积和缠结，阻碍 T 细胞浸润并导致不良预后。本研究还揭示了 TME 中TLS的不同状态。激活的 TLS 与预后改善相关，而缺氧微环境似乎会抑制 TLS 发展并与不良预后相关。本研究对 NSCLC ICB 化疗反应所对应的不同细胞和分子成分提供了新的见解，这将有利于未来个性化的免疫化疗。