文献解读|Nat Cancer（22.7）：与肺癌 T 细胞浸润、炎症和免疫编辑相关的免疫肽组景观

在肺癌患者中，研究表明肿瘤免疫微环境 (TME) 在患者之间和患者内部存在很大差异。根据细胞毒性 T 细胞浸润的程度，可将肿瘤分为两种主要亚型：浸润型和免疫排斥型。浸润性肿瘤患者通常对免疫检查点阻断 (ICB) 疗法反应更好。但从不吸烟的肺癌患者对 ICB的反应较差，与低肿瘤突变负荷 (TMB)、低新抗原负荷和程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1) 表达较低有关。

目前尚不清楚 T 细胞浸润的肺癌肿瘤中存在的人白细胞抗原(HLA)结合肽水平是否与免疫排斥的肿瘤中HLA结合肽水平有显著不同，也不清楚哪些免疫原性抗原介导肿瘤杀伤。因此对肿瘤抗原状况的更全面了解将有助于合理开发针对 T 细胞浸润和免疫排斥型肿瘤更有效的免疫疗法。

在本研究中，研究者团队分析了来自相同肿块的多个肺肿瘤区域的集合，以及来自初治患者中收集的 8 个原发性非小细胞肺癌(NSCLC)的配对非恶性相邻肺组织。他们对来自 5 种肺腺癌 (LUAD)、2 种肺鳞状细胞癌 (LUSC) 和 1 种大细胞神经内分泌癌 (LCNEC) 的总共 61 个宏观区域进行了深度蛋白质基因组分析，包括全外显子组测序 (WES) 和bulk 转录组分析(bulk RNA-seq)，以及基于质谱的 HLA-I 和 HLA-II 免疫肽组学分析（图1）。

图1. 肺癌队列的示意图，对多区域组织进行的组织和分析的摘要。

正如预期的那样，他们在 LUAD 样本中发现了包括KRAS和EGFR在内的致癌基因的致病性突变，在 LUAD 和 LUSC 样本中发现了TP53的多个突变（图2a），并且在患者 02671、03023、02672 和 02290 （简称为“吸烟者”）中发现了显著的吸烟突变特征。对已知仅在 LUSC 或 LUAD 肿瘤中过度表达的基因进行主成分分析 (PCA) 验证了样本的分类（图2b）。他们使用定义的免疫相关基因组根据bulk RNA-seq 数据计算了炎症评分，还根据来自癌症基因组图谱(TCGA)的1012个LUAD和LUSC的景观，分析了每个宏观区炎症状态（图2c-d）。在患者和个体患者体内观察到广泛的炎症，而邻近的非恶性肺组织总体评分为炎症。

图2. 致病突变和炎症评分。

(a) 检测到的突变的热图。 (b) PCA分析。(c) 使用免疫相关基因组的表达水平从 TCGA 计算每个宏区域以及 LUAD 和 LUSC 肿瘤的炎症评分。 (d) 每个宏观区域的炎症评分。

他们在每例患者随机选取的一个宏区域组织中，通过苏木精-伊红染色(HE)和T细胞肿瘤浸润标志物[CD3、CD8、颗粒酶B (GrzB)、Ki67、细胞角蛋白(CK)和DAPI]的多重免疫荧光(mIF)染色进行病理分析，确定CD3+CD8+ T细胞浸润情况（图3a-b）。样本 03023、02290 和 02672 中肿瘤区域与基质区域的双阳性 CD3+ CD8+ T 细胞水平以及肿瘤区域 GrzB 水平相对较高。因此，他们将这些样本定义为 CD3+CD8+ 浸润，将其余样本定义为排斥型CD3+ CD8+ T细胞（图3c）。

他们使用 GeoMx 癌症转录组图谱 (CTA) 平台进行空间转录组分析评估了总体炎症水平（按高与低的比例）。使用CD45、CK和DAPI（分别捕获免疫细胞、肿瘤细胞和上皮细胞，并进行分隔），他们为选定了研究每位患者样本的微区域，并进行了空间蛋白质组学和转录分析。根据形态学差异和相关标记，将所选择的微区标注为：(1)肿瘤胰岛区，(2)坏死区，(3)间质区（肿瘤细胞和免疫细胞贡献不同），(4)富含CD45（免疫）细胞区，(5)三级淋巴结构区(TLS)，(6)其他区（包括血管和非恶性肺）（图3d）。与 03023 和 02672 相比，样本 02290 中肿瘤和基质微区域中的 CD45 表达相对较低，与 02289、02671 和 03421 相比，样本 02287 和 02288 中的 CD45 表达相对较低。因此，他们将样本 02290、02287 和 02288 定义为相对较低的炎症，将其余的样本定义为高炎症（图3e）。

基于以上结果，他们将患者进行相对的二维(2D)空间分组。在横轴上，根据CD3+ CD8+ T细胞浸润的规模对患者进行排序，在纵轴上，根据总体炎症水平对患者进行排序（图3f）。特别是在肿瘤微区，免疫相关基因CCL5、CD27 (PD-L1)、CD8A、CMKLR1、CXCL9、CXCR6、 IDO1、LAG3、NKG7、PDCD1LG2 (PD-L2)、PSMB10和STAT1的表达与CD45表达谱一致（图3g）。此外，免疫浸润肿瘤中的肿瘤微区有望更好地“反映”大块组织，因为这些微区包含免疫隔室的成分，而不是免疫排斥肿瘤的微区域。

将每个肿瘤微区的GeoMx基因表达谱与相应患者的bulk RNA-seq数据相关联，揭示了标记为CD3+CD8+T细胞浸润-低（02290）、CD3+CD8+T细胞浸润-高（03023和02672），排斥-高CD3+CD8+T细胞（02289、02671和03421）和排斥-低CD3+CD8+T细胞（02287和02288）（图3h-j）。有趣的是，与LUAD相比， LUSC肿瘤具有更多的异质性，这是由于肿瘤内在因素（例如驱动突变、拷贝数变异、基因表达谱）和TME的异质性组成，而这些因素通常是相互关联。相关性方差揭示了两种LUSC肿瘤比LUAD更具变异性（图3 k）。肺腺癌（02287、02671和03421）与肺鳞状细胞癌（02288和02289）的差异无统计学意义（图3l）。然后，他们以类似地方式比较了宏观和微观区域之间的相关方差，仅对于排斥型的肿瘤，LUSC与LUAD相比具有更高的差异（图3m），证实这两种LUSC肿瘤确实异质性更强。此外，仅考虑5例LUAD病例，在排斥型的肿瘤中，微观和宏观区域之间的相关性差异明显更高（图3n）。

图3. 将肿瘤定义为免疫排斥、浸润、免疫低和免疫高。

(a-b) 03023-02和 02288-07的 mIF 图像展示了定义肿瘤和基质内表达 GrzB 的 CD3 + CD8 +双阳性 T 细胞浸润。 (c) 每位患者的 mIF 定量。(d) 手动选择的微区域，没有独立重复，并分为肿瘤、基质、TLS、富含CD45+和“其他”。(e) 根据 GeoMx 转录组计算的肿瘤和基质微区域中的 CD45 表达。(f)分类方案。 (g) 根据GeoMx转录组计算的免疫激活标记物在肿瘤微区域中的表达。 (h) 所有微区域的转录组与所有宏观区域相关。 (i) 框中这些相关性的平均方差计算为每个患者的相关系数的方差。(j) 肿瘤方差增加。(k) LUSC肿瘤表现出更高的方差。(l) 在免疫排斥的肿瘤中，luad和LUSC中肿瘤微区之间的相关性方差相似。(m) 免疫排斥肿瘤中宏观和微观区域之间相关性的方差。 (n) LUAD 显示免疫排斥肿瘤中微区域和宏观区域之间的差异显著更高。

HLA-II 复合物通常在 TME 的各种免疫细胞上大量且组成型表达。此外，肿瘤内在和外在因素可能影响它们在恶性细胞上的表达。为了研究这些因素如何影响 HLA-II 免疫肽组，他们首先评估了不同微区域中 HLA-II 呈递机制的表达。与其他组相比，HLA-II表达在浸润高的肿瘤微区域中较高，但与基质微区域相似（图4a）。

他们评估了肿瘤的HLA-DRB表达，发现其在肿瘤区域的表达高于其在间质区中，特别是在LUAD患者03421和02672中（图4b），在这些患者中，HLA-II分子定位于肿瘤细胞膜（定义为HLA-II+肿瘤）（图4c）。

LUAD主要起源于已知组成性表达HLA-II的肺泡2型(AT2)细胞亚群。小鼠模型表明，AT2 细胞去分化进入 LUAD 状态是由谱系转录因子 NKX2-1 的缺失引发的，NKX2-1 是肺分化的主要调节因子。NKX2-1在LUAD肿瘤微区表达量明显高于LUCS，在LUAD HLA-II+肿瘤中表达量略高于LUAD，但不显著（样本03421和02672）（图4d-e）。

参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性激活因子，包括CASP4（一种炎症性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，作为炎症小体的重要效应物）和人类生长和转化依赖蛋白(HGTD-P)，后者在应对缺氧时促进内在凋亡（图4f-g）。

GO分析显示，与HLA-II和HLA-I上外源抗原的处理和递呈相关的基因显著富集，而与细胞周期、转录调节和DNA损伤的细胞反应相关的基因主要富集在HLA-II-肿瘤中（图4h）。

图4. HLA-II 表达概述。

(a) HLA-II呈递机制基因在所有测量的GeoMx区域的表达。 (b) mIF法定量HLA-DRB在间质和肿瘤区域的表达。(c) 仅在03421和02672样本中检测到在癌细胞表面表达的HLA-DR分子。(d) 转录因子NKX2-1在LCNEC、LUAD和LUSC肿瘤间质和肿瘤微区的表达。(e) NKX2-1在间质、TLS和CD45+微区（图中为间质）以及HLA-II+肿瘤微区、HLA-II−和LUAD肿瘤中的表达。(f-g) HLA-II 采样分数及其 GO 分析 。 (h) 对 HLA-II +与 HLA-II −进行GO分析。

在浸润性肿瘤和吸烟者中发现 CD8+和 CD4+ T 细胞及其活化的对应细胞的HLA-II 呈递水平显著较高，但在标记为免疫-高的肿瘤中却没有发现（图5a-c）。相比之下，CD14+、未成熟和成熟的树突状细胞以及CD19+和活化的CD19+细胞仅在免疫-高的肿瘤中有更多的表达。活化的CD8+和CD4+ T细胞以HLA-II免疫肽表达，甚至更多地以其活化状态表达，特别是在T细胞浸润的肿瘤和吸烟者中，而B细胞和树突状细胞的呈递与总体高炎症相关。

他们聚焦于所有在HLA-II肽段中发现的源基因，基于它们在微区域中的表达，将这些源基因分组为肿瘤相关或间质、TLS和CD45+相关（图5d-i）。在T细胞浸润程度高的患者样本（02672和03023）中，间质、TLS和CD45+相关的CD79B基因的表达与所有微区域的B细胞丰度高度相关，而在排斥型的T细胞浸润程度高的患者样本（03421、02289和02671）中，间质、TLS和CD45+相关的CD14基因的表达与巨噬细胞高度相关（图5h-i）。

最后，为了评估哪些免疫细胞类型与 HLA-II 肽组最相关，他们用 Pearson 相关系数总结了每种细胞类型的所有基因的 HLA-II 呈现采样分数（图5j-k）。有趣的是，高浸润样本的 HLA-II 肽组（以这些源基因的呈现为代表）与肿瘤微区域中CD8+ T 细胞、细胞毒性 T 细胞和耗竭的 CD8 + T细胞有关（图5k）。

图5. CD3+ CD8+T细胞浸润影响 HLA-II 免疫肽组。

(a-c) 基于肿瘤中免疫细胞标记物的采样评分。 (d) 浸润-高样本中肿瘤与基质+TLS+CD45 +微区域的基因表达比较的z分数分布。(e) 浸润-高样本中 CD79B 表达与 B 细胞丰度的相关性。(f)免疫排斥-高样本中肿瘤与基质+TLS+CD45 +微区域的基因表达比较的z分数分布。(g) 免疫排斥-高肿瘤中 CD14 表达和巨噬细胞丰度的相关性。(h-i) 浸润-高和免疫排斥-高样品中基质+ TLS + CD45+微区或细胞型丰度肿瘤微区所有基因的相关性。(j-k) 浸润-高和免疫排斥-高中与不同免疫细胞类型相关的基因取样得分之和。

他们定义了一组893个肿瘤相关基因，统称为TAA，这些基因在至少一个肿瘤宏区域中表达，但在基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression, GTEx)数据库中的任何非恶性组织或任何相邻的健康宏区域中均无表达（图6a）。在所有患者中，肿瘤宏区域中TAA的表达高于相邻健康宏区域（图6b-d）。此外，TAA在CD3+CD8+T细胞排斥型的肿瘤上更显著的表达（图6d），并且TAA主要由HLA-I复合物呈递（图6e）。

为了推断肿瘤呈递TAA 的倾向，他们通过用 TAA 基因表达和 HLA-I 表达水平标准化 HLA-I 采样评分来计算 TAA 的平均呈递效率。值得注意的是，相对于炎症-高、CD3+ CD8+ T 细胞浸润的样本和吸烟者，分类为免疫-低或排斥型CD3+CD8+ T 细胞的肿瘤宏观区域以及非吸烟者的平均呈递效率更高（图6f-h）。

他们生成14个HLA-I和4个HLA-II肽（图6i）。来自黑色素瘤相关基因家族来源MAGE-A1和MAGE-A4的10种HLA-I结合肽，已知在许多肿瘤类型中表达，但在除睾丸和胎盘外的正常组织中不表达，在本项研究中，其主要在排斥型CD3+CD8+T细胞的LUSC肿瘤中表达和呈递（即02288和02289），证明LUSC与MAGE-A4表达有关。

图6. 肿瘤相关基因的表达分析。

(a) 肿瘤相关源基因的表达。(b-c) 在所有患者中，肿瘤大区域中存在源TAA的表达高于相邻健康大区域，而非存在源TAAs的表达更高。 (d-e) 呈递源TAA在CD3+CD8+ T细胞免疫排斥的宏观区域中表达更高，主要由HLA-I复合物表达。 (f-h) TAA的呈递效率。(i) 仅在肿瘤宏观区域中出现的 TAA 的热图。

接下来，他们通过计算克隆突变（在所有宏观区域中观察到）和亚克隆突变（在宏观区域的子集中观察到）的发生率来定义肿瘤内异质性，并推断每个肿瘤的系统发育（图7a）。TMB、肿瘤中 GrzB 的表达和吸烟突变特征的检测呈正相关（图7b-d）。此外，他们发现CD3+CD8+ T细胞浸润（在患者03023、02672和02290中）以及吸烟突变特征（在患者02671、03023、02672和02290中）与较高的躯干突变比例显著相关（图7b-f）。

已有研究证明，罕见的长期胰腺癌幸存者，其原发肿瘤中T细胞活性更强，尽管有更多的时间积累突变，但复发肿瘤的遗传异质性更小，高质量的免疫原性新抗原更少（图7g）。

在本项研究的队列中，新抗原质量最显著的差异存在于两名高浸润患者03023和02672的躯干突变和私有突变中，其中躯干突变的质量较低（图7h-j）。

图7.新抗原介导的免疫编辑导致更高比例的躯干突变。

(a) 基于每个患者所有区域中发现的所有高置信度突变的系统发育树。 (b) 绘制每个患者的私有(private)、共有的和躯干突变的数量以及计算每个患者的躯干突变的分数。 (c-d) TMB与吸烟状况以及GrzB在肿瘤亚区表达呈正相关。(e-f) 较高比例的躯干（克隆）突变与吸烟状态和CD3+CD8+ T细胞浸润显著相关。(g) 预测新抗原质量模型的示意图概述。(h) 每位患者个体和躯干突变的新抗原质量评分分布。(i-j) 在免疫排斥和浸润性肿瘤中，新抗原质量与私有突变的比值。

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