文献解读|Nat Commun（14.7）：创伤后深静脉血栓患者血浆代谢和蛋白质组综合状况

深静脉血栓形成 (DVT) 是一种严重的健康问题，可导致多种并发症，例如血栓后综合征、复发性 DVT 和危及生命的肺栓塞 (PE)。DVT和 PE 统称为静脉血栓栓塞症 (VTE)。尽管先前的研究发现了与VTE相关的几种代谢改变，包括肉碱、肉碱种类、葡萄糖、苯丙氨酸、3-羟基丁酸、乳酸、色氨酸和一些单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，但目前对创伤后 DVT (pt-DVT) 的整体代谢改变的理解仍然有限。

根据严格的纳入/排除标准，共 680 名患者纳入发现队列（N  = 580）和验证队列（N  = 100）。简而言之，对于发现队列，研究团队选择 252 名诊断为 pt-DVT 的患者作为病例，选择 328 名无 DVT 的患者作为对照，这些患者于 2018 年 10 月至 2020 年 12 月期间入组。随后，从 2021 年 3 月至 2021 年 7 月，选择了 50 名 pt-DVT 患者和 50 名对照，招募标准与单独的验证队列相同（图1a-b）。为了研究 pt-DVT 的潜在代谢机制并在创伤性骨折患者中识别 DVT 患者，他们采用非靶向代谢组学和液相色谱-质谱 (LC-MS) 技术系统地表征 pt-DVT 患者与对照组之间的血浆代谢物谱，并筛查与 pt-DVT 相关的血液学改变（图1a-b）。

根据KEGG通路分析，将鉴定的代谢物分为8个功能组和1个未知组（图 2a），包括脂质、氨基酸、外来化合物、碳水化合物、核苷酸、肽、辅因子和维生素、能量等。进行主成分分析(PCA)以评估代谢分析中的整体代谢变化和数据质量。在PC 1和2中获得了最佳的组分离。火山图通过单变量分析可视化了两组之间显著增加/减少的代谢物（图 2b）。对于多变量分析，他们实施了正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)（图 2c），并确定了96种对变异有显著贡献的代谢物（图 2d）。通过单因素和多因素分析，共有28种代谢物是显著变化的代谢物，包括11种脂质、5种氨基酸、3种碳水化合物、2种肽、2种核苷酸、2种外源物、1种能量代谢组和2种其他组。所有28种代谢物用于在热图中进行层次聚类，将两组分开（图2e）。

去偏稀疏偏相关 (DSPC) 网络显示了偏相关系数显著的关系（图 3a）。网络拓扑结构表明，功能间和功能内代谢物组之间都存在密集的相互作用，其中脂质和氨基酸代谢之间的相互作用最密集。此外，功能未知的代谢物主要占据靠近这两个代谢物组 N2、N2-二甲基鸟苷和丙酮酸的位置，表明它们可能参与脂质、氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代谢。总之，这些发现表明，高度协调的代谢物调控网络是血栓形成的基础。

对于通路分析，总共 307 种代谢物可以映射到 52 条 KEGG 通路。他们鉴定了 17 条涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢的显著失调通路（图 3b），表明 pt-DVT 组存在大规模代谢失调。17 条显著改变的通路的差异丰度 (DA) 评分显示，涉及氨基酸代谢的 6 条通路活性升高（图 3c）。与碳水化合物代谢相关的所有 5 种通路的活性均显著上调，包括研究较多的柠檬酸循环(TCA)和糖酵解/糖异生。而与脂质代谢相关的所有 3 种通路的活性均降低。此外，他们确定了几种在 pt-DVT 中研究较少的氨基酸代谢通路，例如半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及组氨酸代谢。

他们确定了14个显著变化的临床参数 (CP)，其中5个在pt-DVT患者中增加，其余的减少（图 4a）。Pearson相关性分析显示CP显著增加/减少并且趋于聚集在一起（图 4b）。有趣的是，具有功能相似的临床特征分在一个聚类内，例如最显著增加的CP聚类包括纤维蛋白原（Fbg），血小板血细胞比容（PCT）和血小板计数（PLT），而减少最多的聚类包括红细胞计数（RBC），血细胞比容百分比（HCT）和血红蛋白浓度（HGB）。基于这些，他们揭示了pt-DVT的两个典型临床特征，一个是增加的PLT-PCT-Fbg聚类（称为PLT聚类），另一个是减少的RBC-HCT-HGB聚类（称为RBC聚类）。他们进一步评估了PLT和RBC聚类中这6种CP对pt-DVT的诊断效果。结果表明PLT和PCT对pt-DVT具有良好的特异性，可能是有希望用于临床的诊断标记物。

Pearson相关矩阵显示了 PLT 和 RBC 聚类的不同代谢模式。总共有 25 种代谢物与 6 种 CP 中的至少一种表现出显著相关性，其中 18 种代谢物与 PLT 聚类相关，而 17 种代谢物与 RBC 聚类相关，这表明聚类内的 CP 具有相似的代谢模式。接下来，使用线性回归模型，他们发现16种代谢物与PLT聚类显著相关（图 4c），15种代谢物与RBC聚类相关（图 4d）。8条可能调节PLT聚类改变的代谢通路主要参与脂质代谢，特别是脂肪酸的氧化。他们在这些通路中确定了4种关键代谢物，包括丙酰肉碱、l-肉碱、5,6-DHET和5-羟色胺。血浆丙酰肉碱、l-肉碱和5-羟色胺水平升高与血液中的PLT数量、PCT和Fbg水平呈正相关。此外，有 26 条代谢通路与红细胞聚类相关（图 4f），包括参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢的通路。除了脂肪酸氧化和其他与脂质代谢相关的通路外，咪唑乙酸和丙酮酸水平升高与血液中的红细胞数量、HCT 和 HGB 水平呈负相关。它可能通过碳水化合物和氨基酸代谢促进 pt-DVT 发病机制，例如 TCA 循环的另外两种能量代谢和糖酵解/糖异生。

为了验证预测模型的泛化能力，他们对来自独立验证队列的 100 名参与者进行了代谢组学分析。首先，他们使用上面确定的所有显著改变的 CP和代谢物评估了三个模型的性能，  发现包含 28 种代谢物的模型 2 和包含 42 个预测因子的模型 3 在发现队列和验证队列中均表现出出色的可预测性。仅使用 CP 预测 pt-DVT 的模型 1（发现队列：AUC = 0.873，验证队列：AUC = 0.857）的性能最差，这表明仅使用 CP 可能不足以目前诊断 pt-DVT（图5a-b）。相应地，模型 2（发现队列：AUC = 0.956，验证队列：AUC = 0.935）和模型 3（发现队列：AUC = 0.935，验证队列：AUC = 0.910）能够很好地区分 DVT 与创伤患者，这表明血浆代谢物在临床上对 pt-DVT 早期诊断和预测具有重要贡献（图5a-b）。尤其是包含9种代谢物[十六烷二酸、丙酮酸、L-肉碱、血清素、PE（P-18:1（11Z）/18:2（9Z,12Z））、3-羟基癸酸、5,6-DHET、3-甲氧基苯丙酸和戊腈]的模型2的性能在发现队列和验证队列中均优于其他模型，表明其具有更好的可预测性和泛化能力（图 5c）。

考虑到蛋白质组学可通过分析代谢蛋白提供有见地的代谢视角并有助于理解 pt-DVT 代谢，他们对来自本研究队列的 96 名 pt-DVT 患者和 87 名对照参与者进行了全蛋白质组学研究。总共定量了 524 种血浆蛋白质，并鉴定出 214 种蛋白质在两组之间存在差异，其中 153 种蛋白质在 pt-DVT 患者中上调，61 种蛋白质下调（图 6a）。KEGG 通路富集差异蛋白发现，在 pt-DVT 患者中 15 条通路发生显著改变（图 6b）。值得注意的是，补体和凝血级联改变最显著的通路，这也是直接导致 DVT 的调节通路。

结合代谢组学和蛋白质组学的研究结果，他们发现糖酵解/糖异生在代谢物和蛋白质水平上都发生了变化。糖酵解/糖异生为 TCA 循环产生丙酮酸，研究表明，pt-DVT 患者的丙酮酸、柠檬酸和糖酵解/糖异生通路中的几种蛋白质显著增加。因此，可以合理地推测糖酵解/糖异生的上调可能导致血栓形成的发病机制。这促使他们通过整合代谢组学和蛋白质组学数据进一步探索糖酵解/糖异生的作用。他们发现丙酮酸上游的 8 种蛋白质（LDHA、LDHB、GAPDH、GPI、PKM、MINPP1、ENO1 和 TPI1）在 pt-DVT 患者中显著上调。丙酮酸级联的糖酵解/糖异生-TCA 循环是生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 的主要来源，而 NADH 在细胞氧化还原状态中起着至关重要的作用（图6c）。先前的研究表明，红细胞中的活性氧 (ROS) 会改变红细胞膜结构，并在血栓形成中增强。与这些报告一致，这些数据表明 ROS 相关的过氧化物酶受到轻微干扰，pt-DVT 中的 PRDX5 上调，PRDX2 下调。

总之，本研究代谢组学和蛋白质组学数据强调，干预糖酵解/糖异生和氧化还原稳态可能成为pt-DVT的潜在治疗靶点。基于这些结果，他们对数据中与糖酵解/糖异生和氧化还原稳态相关的相关蛋白质进行了药理学分析，并确定了50种针对糖酵解/糖异生和氧化还原稳态的潜在化合物，从而有利于后续的功能研究和药物开发。

本项研究整合了血浆代谢组学和蛋白质组学，以评估多达 680 名pt-DVT患者和未患 DVT 患者的代谢变化及其功能，确定了与 pt-DVT 相关的 28 种代谢物和 2 个临床参数聚类。然后，他们开发了一组 9 种代谢物，可以高效预测 pt-DVT。此外，代谢组学和蛋白质组学数据的整合分析表明，糖酵解/糖异生-TCA 循环的上调可能通过调节红细胞中的 ROS 水平来促进血栓形成，这表明干扰这一过程可能是 pt-DVT 的潜在治疗策略。