文献解读|Nature（50.5）：儿童 T 系急性淋巴细胞白血病的基因组分析

T 系急性淋巴细胞白血病 (T-ALL) 是一种高风险肿瘤，其基因组尚未得到全面的表征，部分原因是非编码基因组改变的频率很高，这导致致癌基因失调。

研究团队对儿童肿瘤队列(COG) AALL0434 试验中接受治疗的 1300 多名 T-ALL 患者的肿瘤和生殖系样本进行了全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES) 、全转录组测序 (WTS)、单细胞转录组分析(scRNA-seq)和染色质转座酶可及性测序分析 (ATAC-seq) 。他们使用了均匀流形近似和投影 (UMAP) 技术和 Leiden 算法在二维中投影和聚类 WTS 基因表达数据（图1a，图S1）。鉴定了15 种具有不同驱动因子和致癌基因表达模式的 T-ALL 亚型（图S1b-e），包括 TAL1、TAL2、LMO1、LMO2 或 LYL1 转录调节因子失调或 TLX1、TLX3、NKX2-1 或 HOXA9 失调的亚型。在 95.1%（1309 例中的 1245 例）的病例中发现了假设的驱动因子，其中 59%（1309 例中的 777 例）位于基因组的非编码区域（图1b-c）。在4.9%的病例中未发现定义亚型的驱动因子，其中39%的肿瘤纯度低，聚集在髓系特征富集的组[肿瘤微环境(TME)富集组]（图S1f）。

结合scRNA-seq和ATAC-seq数据，他们发现15 种 T-ALL 亚型涵盖了正常 T 细胞成熟的连续阶段（图1d，图S1g），包括从未成熟的造血干细胞 (HSC) 或造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 到常见的淋巴祖细胞 (CLP)、淋巴髓样引发祖细胞 (LMPP) 或 BCL11B 和早期 T 细胞前体 (ETP)样亚型细胞。pro/pre-T 细胞与 KMT2A、TLX3 和 MLLT10 亚型相似。循环双阳性 (DP) 细胞类似于 HOXA9 T 细胞受体 (TCR)、TLX1、NKX2-1 和 TAL1 DP 样亚型。表达 TCRA的单阳性/成熟 αβ 细胞类似于 TAL1 αβ 样亚型。最后，γδ/效应 T 细胞类似于 LMO2 γδ 样亚型，后者也与 TCRγδ 重排有关（图S1h）。他们还观察到髓系特征的富集，包括 SPI1 亚型的树突状细胞 (DC)、NKX2-5 的粒细胞/单核细胞祖细胞 (GMP) 和 STAG2/LMO2 亚型的巨核细胞/红细胞前体 (MEP) 细胞。

他们在之前识别的亚型中发现了其他基因组改变（图2）。例如，TLX3亚型中TLX3的失调通常是由于劫持(hijacking)了BCL11B (ThymoD)增强子，但他们发现了多个发生重排和TLX3失调的额外增强子，包括TCRβ位点、CDK6、notch1驱动的MYC增强子(N-Me)和SATB1增强子。

根据基因组和临床特征，他们将几种亚型划分为亚组。TAL1、TAL2、LMO1、LMO2 或 LYL1 核心转录回路失调的病例可分为两种亚型，先前称为 TAL1-RA 和 TAL1-RB 。考虑到本研究的肿瘤和正常祖细胞基因组数据，他们将这些亚型称为 TAL1 αβ 样和 TAL1 DP 样亚型。TAL1 DP 样亚型表现出更高的RAG1、RAG2、CD4和CD8表达，而 TAL1 αβ 样亚型的特点是 TCRα 常数 (TRAC) 基因表达更高和 TCRα/β 重排（图2，图S1h）。这些亚型中已知的驱动因子是STIL::TAL1，TAL1、LMO1、LMO2和LYL1重排为 TCRδ/β 增强子，以及产生TAL1新增强子的非编码序列突变。他们确定了多种其他致癌基因失调机制，包括拷贝数变异(CNV) 和单核苷酸变异 (SNV)和插入/缺失突变(indel)，这些突变会产生TAL1、LMO2和LYL1的新增强子，以及导致增强子劫持(enhancer hijacking)介导的TAL1和LMO2失调的基因间倒位和缺失。

他们定义了另外两种亚型。ETP 样亚型富含 ETP 免疫表型病例，并具有多种基因组驱动变异。LMO2 γδ样亚型具有多种变异，包括BCL11B增强子劫持、FOXP1重排、 MYC重排为 TCRδ 以及增强子SNV /indel 激活LMO2（图S1h -j）。

他们观察到亚型与临床特征之间的关联。STAG2/LMO2、NKX2-5 和 SPI1 T-ALL 组患者诊断时年龄较小，而 BCL11B 和 HOXA9 TCR 亚型中老年患者的比例更高（图S1k-l）。不同亚型的性别分布不同，STAG2/LMO2、ETP-样、HOXA9 TCR、LMO2 γδ-样和 NKX2-5 亚型中女性患者比例较高，TAL1 亚型中男性患者比例较高（图S1m）。总的来说，这些研究结果表明 T-ALL 亚型主要由非编码驱动基因改变和细胞分化阶段来划分。

他们在 70.5% 的病例中观察到增强子介导的致癌基因激活，在 43.9% 的病例中需要 WGS 才能检测到这些激活。这些激活包括易位、倒位、染色体碎裂和缺失，在 50.4% 的病例中观察到 12 个增强子与 61 个致癌基因并列，在 34.8% 的病例中序列改变导致 8 个基因产生新增强子（图3a）。他们对 19 个 T-ALL 样本（包含 6 种亚型的 19 种不同改变）使用了 ATAC-seq 和组蛋白 3 赖氨酸乙酰化 (H3K27ac) HiChIP 技术，以检测染色质的可及性以及与致癌基因的相互作用和假定的增强子。通过 HiChIP 验证了50 个基因，其中 23 个发生了显著突变、劫持的 TCR 增强子以及失调HOXA13、HOXA9和LMO3 的事件。

他们检测到TAL1下游 28 kb 处反复出现的TAL1增强子增益（中位大小 133 bp）， TAL1下游 20 kb 处增强子SNV / indel，TAL1第一个内含子中的 SNV/indel以及TAL1上游的增强子插入缺失，它们都是 CD34 +细胞而非 DP 细胞中的活性增强子（图3b）。他们使用 ATAC-seq、HiChIP 和异构体测序(iso-seq)验证了TAL1增强子增益（图3c）。

几个增强子劫持事件与发育阶段有关。TAL1基因间易位至CD1基因座导致CD1E增强子发生劫持，这种增强子在正常 DP 细胞和胸腺 CD34+CD1a+细胞中活性较高，但在 BM CD34 +细胞中活性较低。同样，在 TAL1 DP 样亚型中观察到LMO2和RAG2之间的基因间缺失，驱动LMO2失调的RAG2增强子在正常 DP 细胞中活性较高，而在 CD34 +细胞中活性较低（图3d）。相反，ETP 样亚型中HOXA13失调的病例表现出位于CASC15基因座内的SOX4增强子的劫持，这些增强子在正常 BM 和胸腺 CD34+ 细胞中的活性高于 DP 细胞，并且经常劫持在 γ/δ 或 CD34+细胞中的MIR181A1增强子（图3e）。

他们在 50 个基因中观察到了非编码和基因内事件，他们已证明或预测这些基因具有多种基因激活和扰动机制。例如，NOTCH1经常含有激活 NOTCH1 信号传导的编码序列突变。他们还在 1.6% 的病例中鉴定了内含子 SNV，这些 SNV 在内含子 28 中产生非规范剪接受体，导致外显子 28 编码序列的近端延伸（图3f-g）。与常见的编码突变相比，内含子SNV驱动了NOTCH1活性的增加（图3h）。

他们在 ETP 样病例中观察到的MED12改变遍及MED12的编码区，这表明功能丧失。为了验证该结果，他们使用基因组编辑在 LOUCY（SET::NUP214）细胞系中使MED12失活，该细胞系与 ETP-ALL 具有免疫表型相似性。他们观察到该模型中组蛋白去乙酰化酶途径基因表达的上调。将这些数据与MED12改变的 ETP 样病例的基因表达谱相结合，结果显示 T 细胞分化标志物CD5和CD28的表达共同降低，干细胞标志物LMO2和HHEX的表达增加（图4a-b）。这些结果表明 MED12 功能的丧失直接导致 ETP 类 ALL 的不成熟特征。

整合基因组分析还揭示了在 ETP 样 ALL 中驱动特定HOXA基因差异失调的机制。具体而言，驱动HOXA9而非HOXA13失调的增强子劫持改变（如TCRB::HOXA9）表明重排断点始终位于两个 CTCF 峰之间，这两个峰划定了CD34+ HSPC 中HOXA9和HOXA13基因座之间的拓扑关联域 (TAD) 边界（图4c）。相比之下，所有导致HOXA13失调的重排的断点都局限于 HOXA13 TAD，从而限制了HOXA9的激活。

虽然28% 的 ETP 样亚型病例不符合 ETP样 ETP-ALL 的免疫表型标准，但它们表现出相似的免疫表型趋势（T 细胞标志物和髓系和干细胞标志物表达较低），包括不存在 TCR 重排、相似成熟阶段、基因组驱动因子和预后（图4d-i）。

他们研究了与临床结果相关的基因组特征。残留疾病(RD)和微小残留疾病(MRD)≥ 0.01%）的阳性率在 ETP 样和 LMO2 γδ 样亚型中尤为常见（图5a）。他们研究了亚型、遗传驱动因子、共同病变、广泛的拷贝数变异(CNV)和改变的通路与 RD 之间的关联。ETP 样驱动因子和共同病变（SH2B3、ETV6、NRAS和WT1）与较高的 RD 风险相关。相比之下，TAL1 亚型相关特征（LEF1、USP7、PI3K和CCND3）与较低的 RD 风险相关。 JAK–STAT 和 RAS 信号通路改变与较高的 RD 风险相关，而 NOTCH、核糖体和 PI3K 通路与较低的 RD 风险相关。

在无事件生存期 (EFS)、无病生存期 (DFS) 和总生存期 (OS) 分析中，SPI1 和 LMO2 γδ 样亚型预后较差。NKX2-5 亚型和 ETP 样 KMT2A、MLLT10 和 HOXA13 基因亚型也有不良预后（图5b）。非 ETP 样 KMT2A 亚型的 MRD 较高，但预后良好，与 ETP 样亚型中的 KMT2A 病例不同。他们观察到单个基因的特定类型的遗传变异会调节结果（图5c），大多数NOTCH1变异具有良好的预后，但内含子 SNV 和基因内丢失与较差的 OS 和 EFS 相关（图5c）。TCR::MYC重排的病例 DFS 较差，而MYC增强子增加的病例 DFS 较好。与其他 PI3K 通路改变相比， PTEN缺失的病例结果明显更差。在 TAL1 亚型中，TCR:: LYL1和LMO2基因间丢失导致RAG/CAPRIN1增强子劫持与较差的结果相关，这与 6q 缺失和RPL10突变形成对比（图5c）。

第二种恶性肿瘤并不常见，但以 SPI1 亚型为主，其中 11 名患者中有 4 名在诊断后一年内发展为致死性组织细胞增生症或髓样肉瘤（图5d）。WGS 和 WTS数据证实，在诊断性 T-ALL 和 LCH 中，起始克隆均含有STMN1::SPI1、CDKN2A缺失和KRAS突变（图5e）。T-ALL样本还表达DC基因（HLA-D、CD1a、CD38、CD45、CD7、CD5和sCD3）， SPI1 T-ALL样本显示富集了正常DC特征（图5f-g）。这些发现表明，SPI1 融合驱动的恶性肿瘤出现在具有 T 细胞和 DC 潜力的祖细胞中，并经常转变为高风险的 DC 相关的第二恶性肿瘤。

他们探索了多种多变量建模方法的实用性，这些方法结合了临床变量、治疗反应和基因组特征，以预测结果并对患者进行风险分层。当使用数值 MRD、临床变量（性别、诊断时白细胞计数 >2 × 105细胞/μl 和中枢神经系统状态）和亚型/变异水平基因组特征（pCox 模型）和遗传亚型（RSF 模型）拟合每个模型时，随机生存森林 (RSF) 和惩罚 Cox 回归 (pCox)模型具有最高的准确率。

pCox 模型结合 3 种临床特征、5 种亚型和 18 种基因组改变，将患者分成四个大小相等的组，5 年 EFS 范围为 65% 至 97%（图6a-b）。SPI1 亚型、ETP 样亚型、PTEN缺失或丢失、PIK3CD SNV/插入缺失和LMO2基因间丢失与较差的结果相关，而 KMT2A 亚型、6q 丢失、RPL10和NOTCH1 SNV/ indel在单变量和 pCox 模型中均与有利的结果相关。这些结果凸显了它们作为独立预后生物标志物的价值（图5b-c和6a）。

他们将RSF 模型简化为四节点生存树 (ST) 模型，该模型通过有针对性地选择特征可用于临床实施。ST 模型能够将患者风险分层为 8 组，5 年 EFS 范围从 45% 到 98%（图6c）。包括 ETP 样驱动基因 KMT2A、MLLT10、NUP98 和稀有驱动基因以及 SPI1、LMO2 γδ 样和 NKX2-5 亚组在内的几种特征无论 MRD 反应如何，预后均较差（5 年 EFS < 60%）。这些患者应考虑进行 HSC 移植或新的免疫疗法，因为即使进行了多药强化化疗，预后仍然较差。相比之下，如果第 29 天 MRD 小于 0.1%，其他几个特征（包括 ETP 样ZFP36L2变异、TLX3 DP 样、TAL1 DP 样 RPL10、NKX2-1、TLX1、KMT2A 和 HOXA9 TCR）具有较好的预后（5 年 EFS > 98%），这群庞大的患者群体可能会从化疗强度的降低中受益。

事实证明，pCox 模型和 ST 均能有效准确预测 ETP 样组和按免疫表型分类的组中个体的结果（图6c）。相比之下，ETP 样亚型的免疫表型不具有预后意义，而 BCL11B 亚型即使免疫表型为 ETP 也具有良好的结果（图5b）。这些发现强调了使用基于基因组的多变量预后分类的必要性。

本项研究对1300多名接受统一治疗的 T-ALL 儿童的肿瘤和缓解样本进行多组学分析，确定了 15 种具有不同基因组驱动因子、基因表达模式、发育状态和结果的亚型。染色质拓扑分析揭示了增强子失调的多种机制，这些机制以亚型特异性的方式涉及增强子和基因，从而证明非编码基因组的广泛参与。多变量结果模型分析显示遗传亚型、驱动因子和伴随遗传变异独立地预测治疗失败和预后。这些发现为该疾病的分类、风险分层和机制理解提供了新的理论依据。