文献解读|Adv Sci（17.521）：结直肠癌衍生的细胞外囊泡通过上调肿瘤相关巨噬细胞中PD-L1的表达促进肿瘤免疫逃逸

基于此，作者旨在探究CRC细胞如何适应巨噬细胞以帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸。

肿瘤组织中心的 CD206+巨噬细胞密度通常高于肿瘤边缘或邻近组织（图 1A），这表明巨噬细胞在浸润 CRC 组织时发生表型转变。与未经处理的巨噬细胞相比，与 SW620 细胞（结肠癌细胞）一起培养的巨噬细胞表现出 CD206high/HLA-DRlow 表型（图 1B，C）。四个不同的 TAM 亚组聚集在一起，发现表现出 CD206 高表型的 S4 在肿瘤中升高（图 1D）。随着 CRC 的进展，TAM 往往属于 S4 亚组（图 1E）。作者发现 S4 亚组表达了高水平的 CD274（PD-L1）（图 1F）。CD206+巨噬细胞的 PD-L1 水平显著高于其他 TAM 亚群（图 1G）。用 SW620 细胞预培养的巨噬细胞降低了 CD8+T细胞比例， PD-L1显著上调（图 1H-I)。PD-L1+CD206+巨噬细胞抑制TME中CD8+T细胞浸润，抗 PD-L1 抗体几乎完全消除了这些影响（图 1J-M）。

这些数据表明 TAM 中的 PD-L1 可抑制 CRC TME 中的 CD8+ T 细胞。

图 1. CRC TME 中巨噬细胞相关免疫的改变

control：未经处理的巨噬细胞 NCM460 cocultured：与NCM460共培养的巨噬细胞

SW260 cocultured：与SW260共培养的巨噬细胞

来自肠细胞系的sEV可以被巨噬细胞有效地吸收 (图2A-D)。PD-L1在SW620 sEV-预培养巨噬细胞中显著上调 (图2E-F)。与对照相比，与CRC sEV孵育的巨噬细胞表现出CD206high/HLA-DRlow表型 (图2G-H)。CRC sEV的引入显著抑制了CD8+T细胞增殖和IL-2分泌 (图2I-K)。CRC细胞可以通过体外递送sEV来培养巨噬细胞并促进巨噬细胞PD-L1表达。

图 2. 源自 CRC 细胞的 sEV 在体外培养巨噬细胞并促进巨噬细胞 PD-L1 表达

通过尾静脉注射将来自 NCM460 或 SW620 细胞的 PKH67 标记的 sEV 施用于小鼠（图 3A）。分离出腹膜巨噬细胞并进行 IF 测定。与体外结果一致，虽然 NCM460 和 SW620 sEV 都有效地进入了巨噬细胞（图 3B），但 SW620 sEV 强烈促进了巨噬细胞中 PD-L1 的表达（图 3C-D）

图 3. 来自CRC细胞的sEV促进体内巨噬细胞PD-L1的表达

作者假设CRC衍生的sEV-miRNA在来源于两种正常肠上皮细胞系和四种CRC细胞系的TME中介导癌细胞巨噬细胞调节并通过miRNA测序进行分析（图4A）。与来自正常肠上皮细胞的sEV相比，7种miRNA在CRC sEV中明显富集。miR-21-5p、miR-1246、miR-200a和miR92a-3p在来自所有四种CRC细胞系的sEV中显著上调（图4B）。与健康对照相比，四种miRNAs（miR-21-5p、miR-1246、miR-200a和miR92a-3p）在CRC患者的血浆sEVs中增加，尤其是晚期CRC患者（III-IV期）（图4C）。

图 4. 诱导PD-L1表达的CRC衍生的sEV-miRNA的筛选

作者筛选了四种已鉴定的miRNA分别转染巨噬细胞。在四种 miRNA 中，miR-21-5p 和 miR-200a 在 mRNA 和蛋白质水平均显著增加了 PD-L1 的表达（图 5D）。与对照 293T sEVs 相比，具有高水平 miR-21-5p 或 miR-200a 的 293T sEVs 显著增加巨噬细胞中 PD-L1 的表达，这些 sEV 处理的巨噬细胞表现出 CD206high/HLA-DRlow 表型（图 5A-C  ）。与抗 PD-L1 阻断的对照相比，sEV-miR-215p 或 sEV-miR-200a 处理的巨噬细胞显著抑制 CD8+ T 细胞的活性（图 5D）。源自 miR-21-5p 和 miR-200a 耗尽的 CRC 细胞的 sEV 降低了巨噬细胞中的 PD-L1 水平，并诱导了巨噬细胞的 aCD206low/HLA-DRhigh 表型,增加了 CD8+ T 细胞的比例和功能（图 5E-H）。

这些数据表明 CRC 衍生的 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR200a 可以协同诱导巨噬细胞中的 PD-L1 表达和 M2 样极化，从而降低 CD8+ T 细胞活性。

图 5. CRC 衍生的 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR-200a 培养巨噬细胞并诱导 PD-L1 表达

RNA 分析表明PD-L1 在内的总共 108 个转录本共表达，108个基因主要富集在几个关键的癌症相关的信号通路(图6 A-B)。在这些途径中，PI3K-AKT 通路中的 PTEN 和 JAK-STAT 通路中的 SOCS1 显著下调。计算机辅助算法也将 PTEN 鉴定为 miR-21-5p 和 miR-200a 的潜在靶标，并通过验证将 SOCS1 鉴定为 miR-21-5p 的潜在靶标（图 6C-D）。miR-215p 显著抑制 PTEN 和 SOCS1 的表达，并增加巨噬细胞中磷酸化 AKT、磷酸化 STAT1和 PD-L1 的表达。同样，miR-200a 显著抑制 PTEN 表达并上调巨噬细胞中的 p-AKT 和 PD-L1（图 6E）。siRNA 介导的巨噬细胞 PTEN 或 SOCS1 沉默可以复制 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR-200a 对巨噬细胞 PD-L1 的影响（图 6F）。总体而言，PTEN和SOCS1的敲低均诱导CD206表达并抑制HLA-DR表达，表明PTEN在调节巨噬细胞分化方面可能比SOCS1发挥更强的作用。随着 miR-21-5p 和 miR-200a 的异位表达或 PTEN 和 SOCS1 的敲低，巨噬细胞降低了 CD8+ T 细胞比例（图 6G-H）。

这些结果表明 CRC 衍生的 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR-200a 通过调节 PTEN/AKT 和 SCOC1/STAT1 通路协同诱导巨噬细胞中 PD-L1 的表达，从而抑制 CD8+ T 细胞功能。

图 6. CRC 衍生miR通过 PTEN/AKT 和 SCOC1/STAT1 通路在巨噬细胞中诱导 PD-L1 表达

将与小鼠 RAW264.7 巨噬细胞混合的小鼠 CT26.WT CRC 细胞注射到 BALB/c 小鼠的侧腹。从植入后的第二天开始，每 3 天通过尾静脉将 293T sEV注射到小鼠体内（图 7A）。sEV-miR-21-5p 或 sEV-miR-200a 单独显著促进肿瘤生长，它们的组合具有更大生长促进作用（图 7B-D）。不同组之间的小鼠体重没有显著差异，这表明 sEV 是无毒的（图 7E）。IHC 染色证实了 PD-L1+ 巨噬细胞和 CD8+ T 细胞之间的负相关（图 7F），表明 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR-200a 治疗显著降低了 CD8+ T 细胞向肿瘤组织的浸润。

这些数据表明 CRC 衍生的 sEV-miR-21-5p 和 sEV-miR-200a 诱导 TAM 中 PD-L1 的表达以抑制 CD8+ T 细胞活性，这有助于 TME 中的免疫抑制，从而促进肿瘤CRC的增长。

图 7. CRC 衍生miR通过 TAM 诱导的体内免疫抑制促进肿瘤生长

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