文献解读|Cell Rep Med（14）：T细胞攻击下黑色素瘤的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学图谱

了解肿瘤细胞如何与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)相互作用对于改进免疫疗法至关重要，但蛋白质水平的变化仍未得到充分研究。通过免疫检查点阻断(ICB)增强患者的免疫系统可以治愈转移性黑色素瘤和其他恶性肿瘤患者。然而，近一半的黑色素瘤患者对目前的ICB疗法无反应，其他实体瘤的反应率也存在异质性，导致相当一部分患者无法获得持久的临床获益。治疗失败与免疫原性抗原数量少、抗原呈递缺陷和/或替代免疫检查点分子的表达有关。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是能够靶向癌细胞的特化免疫细胞，其在免疫“热”肿瘤中的预存活性与ICB疗效的提高相关。然而，目前尚无公认的生物标志物来量化肿瘤内TIL活性并准确预测个体患者的ICB疗效。这凸显了迫切需要改进的治疗策略和可靠的治疗反应预测生物标志物。

为了研究T细胞介导的黑色素瘤细胞攻击过程中的早期信号事件，研究团队使用了一种患者来源的二维共培养系统，其中从肿瘤活检中建立的黑色素瘤细胞系受到从同一活检组织中分离的自体TIL的靶向攻击。

为了开发一种利用质谱磷酸化蛋白质组学分析该系统中磷酸化位点变化的最佳方法，他们首先评估了流式细胞技术（FACS）能否在质谱样品制备前，在保持肿瘤细胞和TIL体内磷酸化状态的前提下，实现二者的物理分离。他们以人鳞状细胞癌SCC-25细胞为模型系统，用重组表皮生长因子（EGF）刺激8分钟。刺激后立即使用热变性SDS裂解缓冲液裂解细胞，以通过灭活蛋白酶、激酶和磷酸酶来保持磷酸化状态。为了模拟FACS相关的样品处理过程，在裂解前将细胞置于冰上孵育3小时，并分别添加或不添加磷酸酶抑制剂（图1A）。该实验表明，虽然延长孵育时间仅略微减少了鉴定出的磷酸化位点总数，但在添加磷酸酶抑制剂的情况下，这种影响可以忽略不计（图1B）。然而，大多数受EGF显著调控的磷酸化位点在冰上孵育后失去了调控作用，而且令人惊讶的是，添加磷酸酶抑制剂后，这种效应更加显著（图1C）。当聚焦于EGFR信号通路时，发现该通路中关键磷酸化位点的动态调控在长时间冰上孵育后受到严重损害（图1D）。磷酸酶抑制剂未能挽救这种调控的丧失，在某些情况下甚至导致了反向调控。进行PTM特征富集分析（PTM-SEA）时，长时间的样品处理显著减少了显著调控的通路数量（图1E），其中在PBS处理的样品中EGFR信号完全消失，而在磷酸酶抑制剂存在的情况下仅部分保留（图1F）。

由于无法使用流式细胞技术（FACS），因此必须在裂解前不进行肿瘤细胞和TIL的物理分离的情况下获取细胞类型特异性信息。为此，他们采用氨基酸稳定同位素标记 (SILAC)法，使用“重”标记氨基酸（K8和R10）标记肿瘤细胞，而TIL则不进行标记（“轻”标记：K0和R0）。将两种细胞分别在含有“中重”标记氨基酸（K4和R6）的培养基中共培养2小时和6小时。这种方法确保了无法归类到特定细胞类型的新合成蛋白质能够正确分类。作为对照，他们将肿瘤细胞和TIL分别培养，并在裂解前立即混合（图2A）。

肿瘤-TIL配对的选择基于其在初步实验中表现出的高抗肿瘤反应性和高效的肿瘤细胞杀伤能力。流式细胞术评估抗肿瘤反应性证实，所有选定的配对均表现出显著的TIL激活，表现为共刺激分子CD137、脱颗粒标志物CD107a的上调以及IFNγ和TNFα分泌的增加（图2B）。为了在保持细胞毒性相当且不造成过度细胞死亡的情况下捕捉早期信号，他们进行了效应细胞与靶细胞（E:T）比例的滴定，最终选择1:1的E:T比例用于所有后续的质谱实验（图2C）。在进行任何实验之前，他们使用流式细胞技术分析了黑色素瘤细胞系，以确认成纤维细胞污染极低。此外，还对 TIL 中 CD8+和 CD4+ T 细胞的相对丰度进行了表征，结果表明，四个 TIL 产品中的三个（P905、P915 和 P924）主要由 CD8+ T 细胞组成，而一个（P605）则含有大致相等比例的 CD8+和 CD4+ T 细胞。

为了测试SILAC策略的定量性能，他们选择了一对患者进行初步实验。使用窄窗口DIA（nDIA）方法在Orbitrap Astral质谱仪上分析了全蛋白质组样本，并使用DIA-NN 2.0软件及其plexDIA模块处理了所得的质谱数据。在添加中等重量氨基酸之前（0 h），他们也分别收集并分析了肿瘤细胞和TIL。仅TIL样本几乎全部鉴定出轻标记肽段，重标记通道的平均错误发现率（FDR）为0.1%。在肿瘤样本中检测到的轻标记肽段略多，这可能是由于重氨基酸未完全掺入所致。重要的是，在共培养前0 h，两种细胞类型中均未检测到中等重量标记肽段，因此中等重量通道的平均FDR为0%（图1D）。

在所有样本中，他们可靠地鉴定了蛋白质组数据中约 30000 个蛋白质组。其中，10352 个在重链通道中检测到，9786 个在轻链通道中检测到，9510 个在中重链通道中检测到。约有 11000 个蛋白质鉴定出来，与通道分配无关（图 2E）；10175 个在至少两个通道中共存，8481个在所有三个通道中共存。

鉴于蛋白质周转率最低，他们选择2小时时间点进行磷酸化蛋白质组学分析，以重点关注预先存在的（“旧”）蛋白质中的细胞类型特异性信号传导，从而最大限度地减少中等重离子通道中标记的少量新合成蛋白质的干扰。所有样本均采用低输入磷酸化蛋白质组学方法进行处理。在所有样本中鉴定了15539个蛋白质上的约70000个局部磷酸化位点。其中，37626个磷酸化位点在重离子通道中检测到，16172个在轻离子通道中检测到，14122个在中等重离子通道中检测到。约有40000个磷酸化位点鉴定出来，与通道分配无关（图2F）；其中19290个在至少两个通道中共存，9033个在所有三个通道中共存。平均而言，重通道每次运行分别鉴定出 16157 个和 8048 个磷酸化位点，而轻通道平均鉴定出 5037 个位点，中重通道平均鉴定出 3892 个位点。

他们分别生成了6小时蛋白质组数据（图2G）和2小时磷酸化蛋白质组数据（图2H）的Pearson相关性热图。在所有热图中，主要的聚类均由SILAC通道驱动，这证实了多重分析方法能够有效区分细胞来源（肿瘤细胞与TIL）和新合成蛋白质的比例。在2小时时，中重链通道与重链和轻链通道分别聚类；而在6小时时，它与重链通道聚类在一起，表明后期时间点的大部分新合成蛋白质来源于肿瘤细胞（肿瘤细胞体积更大，因此含有更多蛋白质）。唯一的例外是605号患者的样本，其中重链通道与轻链通道聚类在一起，表明该系统中T细胞产生了更多的蛋白质。这种偏差与该患者体内CD4+ TIL的最高比例相符，与经常耗竭且代谢受限的CD8+ TIL相比，CD4+ TIL具有更高的固有翻译速率。在重离子通道和中重离子通道中，样本始终按患者聚类，其中三名患者（P905、P915和P924）与患者P605的聚类明显不同。有趣的是，TIL并未表现出明显的患者特异性聚类。在磷酸化蛋白质组的重离子通道和轻离子通道以及蛋白质组的中重离子通道中，存在一定程度的按条件（对照组与共培养组）聚类的情况。当使用允许缺失值的欧氏距离作为聚类指标时，这种分离得到了改善。

基于蛋白质组数据，他们进行了差异表达分析，以鉴定所有患者中T细胞攻击后显著调控的蛋白质。在重链或轻链通道中显示调控的蛋白质反映了细胞类型特异性变化，主要解释为共培养过程中差异降解，但也不能排除少量新合成的、含有回收氨基酸的蛋白质的贡献。相反，在中重链通道中调控的蛋白质代表了共培养过程中蛋白质合成的变化，可能来源于肿瘤细胞或TIL。大多数蛋白质丰度变化在6小时时出现在中重链通道中，其中263个蛋白质上调，80个蛋白质下调。

在中重离子通道中上调的蛋白质在四位不同患者中表现出高度相似性（图3A）。由于许多免疫相关蛋白在中重离子通道的对照条件下可能存在大量缺失值，系统地搜索了具有这种模式的蛋白质，并鉴定出38种在共培养后优先表达的蛋白质（图3B）和78种优先不表达的蛋白质。在T细胞攻击后上调或特异性诱导的蛋白质中，他们鉴定出黏附分子ICAM1和VCAM1，它们可能促进稳定的免疫突触形成，从而实现细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的杀伤作用，这得到了CTL关键组成部分PRF1和GZMB存在的支持。他们还发现了一些已知的干扰素-γ（IFN-γ）靶点，例如STAT1和IRF1。与此同时，免疫检查点蛋白CD274（PD-L1）和IDO1的出现，提示肿瘤细胞试图抵抗免疫攻击。经典NF-κB通路（NFKB1）和非经典NF-κB通路（NFKB2和RELB）的激活，以及TNFAIP3等调节因子的表达，反映了持续的炎症信号。包括RIG-I（DDX58）、DHX58、TLR3和AIM2在内的固有免疫传感器也上调，表明免疫介导的应激触发了核酸识别。最后，NAMPT、SOD2和OPTN等蛋白的表达提示了肿瘤细胞的代谢和氧化适应机制，以帮助其应对炎症微环境。

当比较T细胞攻击后新合成的蛋白质与受IFN-γ处理影响的蛋白质时，他们观察到下调蛋白质的重叠极少，而上调蛋白质在两种条件下则基本相同（图3 C）。在24小时，近一半由IFN-γ上调的蛋白质在T细胞攻击6小时后也被诱导，这表明存在一种协同反应，可能是由IFN-γ和共培养过程中释放的其他细胞因子的联合作用以及其他信号通路的激活所驱动的。这一观察结果得到了以下结果的支持：共培养条件下蛋白质差异倍数与IFN-γ在6小时时诱导的蛋白质差异倍数之间缺乏相关性，这与24小时时观察到的更强的正相关性形成鲜明对比。

全基因组 CRISPR-Cas9 筛选已被广泛用于解析 T 细胞与肿瘤的相互作用，并鉴定影响肿瘤细胞在免疫攻击期间存活的基因。在本研究中，他们利用了来自两种黑色素瘤模型的体外CRISPR 筛选数据：一种是经基因工程改造表达模型抗原卵清蛋白 (Ova) 的小鼠 B16 细胞，另一种是内源性表达肿瘤相关抗原 MART-1 的人类 D10 细胞。在这两种系统中，肿瘤细胞均接受了抗原特异性 CTL 的攻击。在筛选终点显著富集（正向筛选）的基因是那些敲除后能提高细胞在 T 细胞压力下存活率的基因，而显著缺失（负向筛选）的基因是那些缺失后会降低肿瘤细胞在 T 细胞压力下存活率的基因。为了将这些发现与蛋白质水平的反应整合起来，他们将 CRISPR 筛选结果与获得的暴露于 T 细胞攻击的肿瘤细胞的蛋白质组学数据相结合。基于两个数据集的变化方向，他们将蛋白质分为两组：一组蛋白质的基因富集并上调或缺失并下调，提示其可能在促进对T细胞杀伤的敏感性方面发挥作用（图4A）；另一组蛋白质的基因富集并下调或缺失并上调，提示其可能与耐药性有关（图4B）。在赋予敏感性的上调蛋白质中，他们鉴定出了IFN-γ靶点STAT1、IRF1和TAP2。值得注意的是，IFN-γ特征此前已被证实与免疫检查点阻断疗法（ICB）高度相关，而TAP2下调已被证明可驱动免疫逃逸和免疫治疗耐药。然而，在本组中，一些IFN-γ靶点（MCL1、PARP12、IFI30、TRIM21和OAS1）呈现相反的趋势，在耐药组中也存在，表明它们可能参与IFN-γ信号的促肿瘤作用，促进免疫逃逸。在耐药组中，他们还发现BIRC2和KDM2A表达上调，而抑制这两种基因此前已证实与T细胞杀伤敏感性增加相关。

为了分离受共培养环境诱导差异性降解的蛋白质，他们将共培养样本与对照组进行比较。在对照组中，肿瘤细胞和TIL分别培养，并在裂解前立即混合，分别针对重链和轻链通道进行分析。该分析捕捉了共培养条件下蛋白质相对稳定性的瞬时状态。为了确保这些变化反映的是特定的降解/稳定事件，而非蛋白质合成过程中产生的假象（例如回收标记氨基酸的重新掺入），他们排除了在新生（中重链）和预先存在的（重链/轻链）蛋白质池中均表现出平行调控趋势的蛋白质。利用这一筛选条件，他们鉴定出几种在肿瘤细胞（图4C）中差异性降解的免疫相关蛋白，包括JAK2、TRAF3和酪氨酸酶（TYR），以及在TIL（图4D）中差异性降解的蛋白，例如CD6和CTSC。

为了证明数据能够捕捉到具有生物学意义的变化，他们对跨膜蛋白细胞毒性和调节性T细胞分子（CRTAM，也称为CD355）的作用进行了功能验证。在四名患者中的三名患者中，共培养6小时后，CRTAM在蛋白质组学数据的中等强度通道中被特异性检测到（图3B）。对所有四名患者进行的流式细胞分析证实，肿瘤细胞与CTL细胞接触后，CRTAM的表达几乎完全上调（图5A），其中P905和P915患者的CRTAM+CD8+ TIL比例超过15%。这种上调需要通过TCR/CD3复合物激活CTL，并可由CD28共刺激进一步增强，且与IFN-γ无关（图5A-B）。共培养后，CRTAM表达迅速上调，在7至24小时达到峰值，随后在48小时恢复至基线水平，表明CRTAM是CTL早期活化的标志物。CRTAM阳性CTL共表达反应性标志物TNFRSF9/CD137和生存标志物IL2RA/CD25（IL2受体的α链）（图5 C），并且与CRTAM阴性CTL相比，其IFN-γ分泌增加（图5 D）。用磁珠刺激健康供体外周血单核细胞（PBMC）后，CRTAM阳性CTL的增殖能力强于CRTAM阴性CTL。这些数据表明，CRTAM可识别具有增强抗肿瘤活性的肿瘤浸润CTL亚群。在来自 33 个黑色素瘤肿瘤的单细胞转录组分析(scRNA-seq)数据集中，证CRTAM 表达主要在 CTL 上；TNFRSF9/CD137 和 IFN-γ 转录本在 CRTAM 高表达的 CTL 中显著富集，而 IL2 受体的 γ 链 IL2RG/CD132 在 CRTAM 阳性细胞中富集。

为了评估CRTAM在CTL介导的黑色素瘤杀伤中的临床意义，他们分析了423例接受ICB治疗的黑色素瘤患者的临床队列中CRTAM基因表达与总生存期（OS）的相关性，并观察到高CRTAM表达预示着OS的改善（图5E），提示其可能作为抗肿瘤免疫活性和临床获益的替代标志物。为了评估CRTAM与OS改善之间的关联是否超越了该队列和黑色素瘤，他们使用TIDE（肿瘤免疫功能障碍和排除）算法中实现的Cox比例风险（CoxPH）回归模型，评估了CRTAM表达在多个黑色素瘤队列和癌症类型中的预后效应。高CRTAM表达与大多数癌症类型的死亡风险降低相关，其中黑色素瘤表现出最强且最一致的保护作用（图5F）。校正 CTL 浸润后，CRTAM 在黑色素瘤中的预测价值显著降低，表明其与生存率的关联主要由 CTL 丰度介导。与此一致的是，CRTAM 表达与各队列的 CTL 水平呈正相关，在黑色素瘤中相关性最强，且与 CD8A 本身接近。综上所述，这些发现表明 CRTAM 表达定义了一部分 CTL，其存在与良好的临床预后相关，这与 CRTAM 在有效的抗肿瘤免疫中发挥作用相符。

在磷酸化蛋白质组学数据中，由于含有中等重标记氨基酸的肽段可能来源于肿瘤细胞或TIL，他们将分析重点放在重标记（肿瘤来源）和轻标记（TIL来源）通道上。他们在重标记通道中鉴定出1145个T细胞攻击上调的磷酸化位点和153个下调的磷酸化位点，在轻标记通道中鉴定出743个上调的磷酸化位点和128个下调的磷酸化位点。此外，还鉴定出特定条件下特有的磷酸化位点，在重标记通道和轻标记通道中分别发现了320个和187个共培养样本特有的磷酸化位点。

黑色素瘤细胞和TIL的磷酸化模式存在显著差异（图6A）。在PhosphoSitePlus数据库中，他们鉴定了两种细胞类型中均存在且具有相关功能的磷酸化位点。其中，TIL中上调最显著的位点是波形蛋白（vimentin）上的丝氨酸（图6B），波形蛋白是AKT1的靶点，已知其影响细胞运动和细胞骨架重组。在TIL中调控最显著但黑色素瘤细胞中未发现的功能性磷酸化位点中，他们发现了几个T细胞活化标志物，例如CD3ζ上的酪氨酸（图6C），CD3ζ是T细胞受体（TCR）信号复合物的关键组成部分。在黑色素瘤细胞中调控最显著且在TIL中也发现的功能性磷酸化位点是DNA-PK上的丝氨酸2612（图6D），已知其可增强DNA修复过程。在两种细胞类型中均受调控的位点中，他们发现了RIPK1上的丝氨酸（图6E），它是MAPKAPK2 (MK2)和TAK1激酶响应TNF-α等炎症刺激的靶点。该位点的磷酸化通过阻止RIPK1与FADD和caspase-8的相互作用来抑制RIPK1介导的细胞凋亡。

在黑色素瘤细胞中，基序富集分析显示，攻击后+1位谷氨酰胺残基的表达显著升高，该残基代表磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶（PIKK）的序列基序，包括ATM、ATR和DNA-PK（图7A）。相反，在TIL中，嗜碱性激酶基序R/KR/Kx-pS/pT在与黑色素瘤细胞相互作用后表达显著升高，凸显了两种细胞类型之间激酶激活的显著差异。接下来，他们采用RoKAI算法，通过分析已知激酶底物及其功能网络的磷酸化变化（图7B），评估T细胞攻击后的激酶活性。与之前的分析结果一致，受攻击的黑色素瘤细胞优先富集了DNA损伤反应（DDR）的核心激酶。这些激酶包括DNA-PK和ATM（它们修复双链断裂），以及复制应激调节因子ATR和Chk1。细胞周期激酶Aurora激酶B也显著富集，此外还有MAPKAPK2和MAPKAPK3（它们是p38 MAPK调节的激酶，参与应激、炎症和DDR）。

为了进一步剖析已鉴定的DNA修复反应，他们重点研究了特定的效应激酶。结果显示，DNA损伤反应（DDR）机制显著激活，尤其是DNA-PK。在暴露于TIL的黑色素瘤细胞中，他们观察到多个已知可促进DNA修复的DNA-PK磷酸化位点上调（图7C）。

为了研究DNA-PK在T细胞攻击过程中的功能相关性，首先分析了接受ICB治疗的临床队列中DNA-PK基因表达与总生存期（OS）之间的关联，发现高DNA-PK表达预示着更差的OS（图7D）。他们在多种癌症类型中证实了这种负性预后关联。重要的是，在校正T细胞浸润水平后，DNA-PK的预测价值仍然存在。与此一致的是，DNA-PK基因表达与CTL浸润的负相关性较弱，表明DNA-PK表达对生存的影响独立于肿瘤微环境（TME）中CTL细胞的丰度。

研究团队对与匹配的自体 TIL 共培养的患者来源黑色素瘤细胞的早期反应进行了分析。为了在不进行物理分选的情况下区分肿瘤和 TIL 的蛋白质组，采用了SILAC技术，并结合了 Orbitrap Astral 数据非依赖性采集 (DIA) 质谱 (MS) 技术。该方法能够对蛋白质磷酸化和降解进行细胞类型特异性分析，同时还能对活跃免疫攻击期间早期新合成的蛋白质组进行整体分析，揭示了黑色素瘤细胞中干扰素-γ依赖性的变化，鉴定出细胞毒性和CRTAM作为反应性 TIL 的选择性标志物，并揭示了肿瘤固有 DNA 损伤反应相关激酶的快速激活，从而暴露了潜在的治疗靶点。总的来说，该平台为剖析肿瘤免疫相互作用提供了强大的资源，从而指导生物标志物的发现并推进免疫疗法。