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常见问题

Q1: 什么是TBS（靶向甲基化测序）？ 

TBS（Targeted Bisulfite Sequencing）是一种将重亚硫酸盐转化与二代高通量测序（NGS） 相结合的技术。其核心原理是：用重亚硫酸盐处理DNA后，未甲基化的胞嘧啶（C）会转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。通过后续PCR扩增和测序，就能以单碱基分辨率精确判断目标区域内每个CpG位点的甲基化状态。

 

Q2: TBS与全基因组甲基化测序（WGBS）、焦磷酸测序相比有什么优势？

与全基因组甲基化测序（WGBS）相比，TBS最大的优势是高性价比和高灵活性。当研究只关注特定基因或CpG位点时，WGBS成本高、周期长。而TBS能以约1/10的成本实现靶向区域的精准分析。

与传统的焦磷酸测序相比，TBS的通量更高，可以同时检测几个到上百个基因或位点，且每个位点的测序深度通常大于200X，能检测到低至1% 的甲基化差异

 

Q3: TBS的数据分析通常包含哪些内容？

标准分析通常包括：

数据质控：过滤低质量数据。

序列比对：将数据比对到目标区域。

甲基化水平统计：计算每个CpG位点的甲基化率。

差异甲基化分析：比较不同样本间的甲基化差异。

高级分析还可包括临床病理信息关联分析等。

 

Q4: TBS技术存在哪些固有的局限性？

任何技术都有其局限，TBS也不例外：

无法区分5mC和5hmC：标准的重亚硫酸盐测序无法区分5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），两者在测序中都会被识别为甲基化。

PCR扩增引入偏好性：文库构建过程中的PCR扩增可能会引入偏好性，导致某些片段的覆盖度不均匀。

短读长测序的覆盖盲区：基于NGS的TBS读长通常为150-250 bp，无法有效覆盖着丝粒、端粒和转座子等高重复区域，导致这些区域的甲基化信息丢失。


TBS

简介


       靶向甲基化测序(Targeted Bisulfite Sequencing，TBS)通过设计相应的探针序列，特异性捕获感兴趣的基因组特定区域，捕获片段进一步通过重亚硫酸盐处理，经高通量测序检测目标区域的甲基化水平，可满足几个到上百个基因/CpG位点的检测。


技术原理


tbs技术原理.png

  该技术是大样本量，固定区域甲基化检测的首选，可广泛应用于临床样本甲基化特异性区域的鉴定以及与疾病相关的甲基化Bio-Marker的筛选和验证。


技术优势

√ 基于亚硫酸盐多重 PCR 扩增捕获测序

√ 高效灵活的目标区域甲基化检测方案

√ 深度测序, 单碱基分辨率, 绝对定量的

√ 可同时检测几百个区域/CpG 位点

√ 普遍用于血液、组织、灌洗液、粪便等

√ 低成本、快周期的，超高性价比优势


送样建议


样本类型

送样量要求

关键操作与注意事项

1. 基因组DNA

总量：≥ 500 ng
浓度：≥ 10 ng/μL

① 质量检测：需提供琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100检测结果，以确认DNA完整性。
② 去除污染：提取时务必加入RNase（核糖核酸酶） 去除RNA，防止干扰定量。
③ 溶解介质：使用TE缓冲液或Elution buffer（洗脱缓冲液） 溶解DNA，避免使用纯水（纯水pH不稳易导致降解）。
④ 浓度测定：必须使用Qubit荧光计进行精确定量，请勿依赖NanoDrop等OD值检测法（其读数易受杂质干扰而严重高估浓度）。

2. 细胞样本

细胞数：≥ 1×10⁶ 个

① 清洗细胞：收集贴壁或悬浮细胞后，用预冷的1×PBS溶液洗涤2次。
② 离心条件：每次洗涤后于600g离心5分钟。
③ 保留沉淀：最后一次离心后，务必尽量吸尽上清PBS，仅保留细胞沉淀，避免PBS残留抑制后续酶反应。

3. 全血样本

体积：0.2 - 5 mL 外周血

① 抗凝管选择：必须使用EDTA抗凝管（紫盖）采集。
② 禁忌说明：严禁使用肝素抗凝管（绿盖），肝素会强烈抑制PCR扩增和酶切反应，严重影响建库成功率和数据质量。

4. 动物组织

重量：> 10 mg
（建议约30 mg / 半粒绿豆大小）

① 清洗血污：采集后立即用预冷的1×PBS溶液漂洗，去除组织表面残留血液（血液中的核酸酶会降解样本）。
② 保存条件：短期保存可置于-20℃；若长期保存（1年以内），请置于-80℃超低温冰箱。

其他样本可咨询内部，评估后确认是否可接入。





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