文献解读|Signal Transduct Target Ther（81.2）：基于大规模高分辨率质谱的蛋白质组学可确定鼻咽癌的分子亚型，从而为治疗靶向提供依据

鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽黏膜的恶性上皮肿瘤，其病因与EB病毒（EBV）感染密切相关。由于鼻咽癌对电离辐射高度敏感，放射治疗是其主要治疗方法。目前，以调强放射治疗（IMRT）联合铂类药物同步放化疗为主要治疗方案，临床试验显示其5年局部控制率超过90%。然而，相当一部分患者在初诊时已处于局部晚期，导致约30%的患者出现局部复发和远处转移，最终导致治疗失败。NPC的精准诊断和治疗仍面临诸多挑战，主要原因在于缺乏基于多组学的分子分型和有效的靶向治疗。

研究团队对87例NPC组织样本和56例非癌性鼻咽组织样本进行了基于同位素串联质谱标签（TMT）的蛋白质组学分析（图1a）。共鉴定出12141种不同的蛋白质，平均每组定量9201种蛋白质。除蛋白质组学分析外，他们还对相同的样本进行了基于TMT的磷酸化蛋白质组学分析，以捕获磷酸化事件（图1a）。该分析鉴定出6066个磷酸化蛋白，包含30106个磷酸化位点，平均每组16256个磷酸化位点。在这些磷酸化位点中，15028个（49.9%）在至少一半的样本中可定量，7881个（26.2%）在所有样本中均能检测到。整合分析显示，5409个磷酸化蛋白（占总磷酸化蛋白质组的89.2%）具有匹配的蛋白质组定量结果。由于后续聚类分析中发现的问题，排除了12个样本（8个NPC组织样本和4个非癌性鼻咽组织样本），后续分析基于剩余的79个NPC组织样本和52个非癌性鼻咽组织样本进行。

为了描绘NPC特异性蛋白质组图谱，他们对肿瘤样本和非肿瘤样本进行了比较分析。在10个组中至少在一个组中可定量的12141个蛋白质中，与非肿瘤样本相比，肿瘤样本中有1038个蛋白质表达上调，1158个蛋白质表达下调（图1b）。GO富集分析显示，肿瘤样本中表达上调的蛋白质显著富集于细胞周期调控、细胞外基质重塑过程和免疫反应等相关通路（图1c）。相反，肿瘤样本中表达下调的蛋白质主要与淋巴细胞活化、适应性免疫功能、代谢通路和纤毛运动等相关（图1d）。整合分析进一步鉴定出差异表达基因，这些基因富集于七个功能聚类中：细胞周期、纤毛功能、免疫应答、代谢、转移、mTOR信号通路和病毒应答（图1e）。值得注意的是，多种干扰素刺激基因（ISG），包括STAT1、MX1、CXCL10、IFIT3、ISG15和OASL，在肿瘤样本中显著上调。这些基因在免疫应答和抗病毒通路中功能富集。这一观察结果与先前报道的鼻咽癌上皮细胞中ISG表达升高相一致，这种现象可能与中国人群中非角化型EBV相关亚型的流行有关。EBV驱动的慢性炎症和病毒持续感染是NPC发病机制中公认的重要因素。值得注意的是，某些特定的ISG（例如STAT1、MX1、IFIT3）具有双重功能：它们在介导抗病毒反应的同时，也可能促进DNA损伤抵抗。鉴于放射疗法在鼻咽癌治疗中的核心作用，这些ISG可能导致治疗耐药，并对患者预后产生负面影响。

在对异常表达蛋白进行表征后，他们评估了肿瘤和非肿瘤样本之间磷酸化位点丰度的差异。在10个样本组中至少在一个样本组中可定量分析的30106个磷酸化位点中，与非肿瘤样本相比，肿瘤中共有1785个磷酸化位点显著异常表达，其中791个位点上调，994个位点下调（图1f）。值得注意的是，大多数磷酸化位点的磷酸化丰度差异倍数高于NPC中相应蛋白丰度（图1g）。差异磷酸化位点的Hallmark富集分析显示，肿瘤特异性激活了细胞周期和上皮间质转化（EMT）通路，而非肿瘤样本中则表现出紫外线反应增强和KRAS信号通路激活（图1h-i）。系统性激酶谱分析评估了不同样本中的蛋白质丰度，并鉴定出PBK、CDK1、VRK2、PTK2、WNK2、EIF2AK2、MASTL、EGFR、DDR1和CHEK2是肿瘤中表达量最高的10种激酶（图1j）。值得注意的是，这些激酶中的大多数也表现出增强的磷酸化模式，其中CDK1、WNK2和EGFR的磷酸化变化相对于蛋白质丰度更为显著，表明它们同时存在过表达和激活。同样，表达量最低的10种激酶，包括PBKCB、BTK、MAP4K1、LCK、MAPK3、CSK、CAMK4、STK10、JAK1和PBKCA，则表现出磷酸化水平降低（图1j）。他们通过激酶底物富集分析（KSEA）方法进一步评估了激酶活性，结果显示 CDK1、CDK2 和 AURKA 的得分最高（图1k）。CDK1 和 CDK2 是经典的细胞周期调控因子，它们的失调与染色体不稳定以及 S 期和 G2/M 期转换的紊乱有关——这些都是肿瘤发生过程中的关键事件。这些发现从机制上解释了肿瘤样本中细胞周期基因在失调蛋白中富集的现象。相反，PAK2、PRKACA 和 CAMK2A 的得分较低，提示它们可能在NPC的抗癌过程中发挥作用。他们还基于肿瘤和非肿瘤组织的蛋白质组学分析检测了这些激酶的表达，结果显示大多数活性激酶显著上调，而活性降低的激酶则下调（图1l）。

目前NPC的组织病理学诊断主要依赖于苏木精-伊红染色和免疫组化标记物（例如CK、EBER和Ki-67），存在假阴性结果的风险，影响部分患者，因此迫切需要新型、高特异性的诊断标志物来提高该人群的诊断准确性。为了解决诊断不准确这一持续存在的风险，他们采用基于机器学习的特征选择方法进行蛋白质生物标志物的发现（图2a）。首先，将特征选择过程中的最大特征数设定为1、2或3（图2b）。以ROC曲线下面积（AUC）为标准，他们鉴定出11个独特的特征，其中“FERMT1”和“IGF2BP3, FERMT1”的特征出现频率最高（图2b）。基于内部构建的蛋白质组学训练集，通过交叉验证评估，“IGF2BP3, FERMT1”特征展现出最佳的预测效能，平均AUC值为1（图2c）。本研究的蛋白质组学数据显示，与非肿瘤样本相比，肿瘤样本中IGF2BP3和FERMT1的表达显著升高（图2d）。IGF2BP3是一种RNA结合蛋白，在转录后调控中发挥关键作用，尤其影响特定mRNA的稳定性和定位，并进而影响其翻译。它与细胞生长和增殖等过程密切相关。FERMT1，又名Kindlin-1，属于Kindlin家族，该家族对于调节细胞黏附和整合素激活至关重要。它通过与整合素相关蛋白相互作用来调节整合素活性，对细胞黏附于细胞外基质和细胞运动至关重要。他们使用临床组织切片的免疫荧光染色进一步验证了NPC组织中 IGF2BP3 和 FERMT1 的表达高于非癌性鼻咽组织（图2e）。

目前，NPC的临床分型主要基于组织病理学标准，分为角化鳞状细胞癌、非角化鳞状细胞癌和基底样鳞状细胞癌三大亚型，其中非角化鳞状细胞癌在中国人群中最为常见。然而，这种基于组织病理学的分类系统缺乏明确的预后价值和明确的治疗指导意义。为了克服这一关键局限性，对NPC进行分子分型对于深入了解其生物学异质性和临床相关性至关重要。本研究旨在利用蛋白质组学分析对鼻咽癌肿瘤样本进行分型，以期识别具有不同表达特征的分子亚型。此外，他们还试图确定这些亚型是否与预后相关，从而帮助识别鼻咽癌预后不良的患者。他们评估了2-6个聚类的平均轮廓系数，发现两个聚类时轮廓系数最大，将这些亚型分别命名为S1和S2（图3a-b），S1和S2亚型分别包含56例和23例肿瘤样本。与S1亚型患者相比，S2亚型患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）均较差（图3c-d）。此外，他们进行了COX回归分析，以确定是否存在与这些亚型相关的风险因素。除吸烟史外，S1和S2亚型患者在其他临床特征方面无显著差异（图3e）。

进一步分析显示，S1 和 S2 亚型之间存在 1962 个差异表达蛋白，其中 S2 亚型中 1187 个蛋白表达上调，774 个蛋白表达下调。深入分析表明，S2 亚型中表达上调的蛋白主要参与补体和凝血级联反应，而表达下调的蛋白则聚集在 MYC 靶点、G2/M 期检查点和 E2F 靶点（图3g-h）。

他们观察到，虽然与非肿瘤组织相比，NPC组织中免疫反应通路普遍富集，但两种分子亚型之间的免疫通路激活存在显著差异。值得注意的是，S2亚型的免疫相关通路富集程度比S1亚型更为显著。为了系统地评估免疫细胞和基质细胞的浸润情况，他们应用了ESTIMATE（基于表达数据的恶性肿瘤组织基质和免疫细胞评估）算法计算基质评分和免疫评分。分析结果显示，S2亚型的免疫细胞浸润水平高于S1亚型（图3h）。基质浸润评分也呈现类似的模式，S2亚型的基质含量更高（图3h）。因此，S2亚型的ESTIMATE评分显著高于S1亚型，表明其肿瘤纯度低于S1亚型（图3h）。对免疫细胞组成的进一步表征揭示了亚型特异性模式。S2亚型表现出强大的免疫细胞浸润，但其微环境主要由免疫抑制细胞群组成，包括髓源性抑制细胞（MDSC）、调节性T细胞（Treg）和Th2细胞，而活化的CD8+ T细胞数量显著减少。相比之下，S1亚型则显示出富含CD8 + T细胞的免疫微环境（图3i）。这些发现提示不同亚型之间存在不同的免疫逃逸机制。S2亚型的免疫抑制表型似乎与补体和凝血级联反应的激活存在机制上的关联。补体成分C3/C5通过其受体C3AR/C5AR1的激活促进了MDSC、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和Treg的募集，从而抑制抗肿瘤T细胞反应。补体介导的基质金属蛋白酶（MMP）诱导通过增强血管生成和细胞外基质重塑进一步促进肿瘤进展。

S2亚型中C3、C5、C5AR1和多种MMP的表达升高，表明补体-凝血通路协同激活可能驱动该侵袭性亚型的免疫抑制和转移扩散。相比之下，S1亚型则表现出增殖信号通路的显著富集。从机制上讲，关键的真核翻译起始因子EIF3J和EIF4F显著富集，它们调控核糖体生物合成和蛋白质合成，从而促进肿瘤细胞增殖。此外，MYC通路中MCM家族成员的协同富集将DNA复制起始和延伸过程与异常增殖活性联系起来。S1亚型中肿瘤纯度的显著升高可能与肿瘤细胞中自主增殖通路的过度激活密切相关。为了验证S2亚型的免疫抑制性浸润微环境，他们对组织芯片进行了多重免疫荧光检测，靶向CD8⁺ T细胞、Treg细胞和MDSC细胞。结果显示，S2亚型中CD8⁺ T细胞浸润显著减少，而Treg细胞和MDSC细胞则呈现增加趋势（图3j-k）。

接下来，他们旨在鉴定具有潜在临床应用价值的亚型特异性诊断特征。为此，进行了特征选择，并将特征数量上限设置为1、2或3（图4a）。以AUC为评价标准，鉴定出六个独特的特征，其中“ACTBL2, UNC13D”特征出现频率最高（图4b）。交叉验证实验表明，“ACTBL2, UNC13D”特征具有优异的预测性能（平均AUC = 0.998）（图4c-d）。与S1亚型相比，S2亚型中ACTBL2和UNC13D的表达水平更高（图4e）。ACTBL2是β-肌动蛋白的同源物，它通过调节细胞骨架动力学和上皮间质转化（EMT）促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。其过度表达与乳腺癌和卵巢癌等癌症的转移和不良预后相关。UNC13D参与淋巴细胞的囊泡分泌和细胞毒性颗粒释放，已证明能促进胰腺癌等实体瘤的肿瘤进展。

为了进一步验证亚型诊断模型，他们对89例外部NPC患者样本进行了ACTBL2和UNC13D表达的定量免疫组织化学（IHC）分析。利用该模型，预测57例患者为S1亚型，32例患者为S2亚型。IHC结果显示，S2亚型中ACTBL2和UNC13D的染色强度显著高于S1亚型（图4f-g）。两种蛋白的亚细胞定位在两个亚型中保持一致，ACTBL2主要定位于细胞质，而UNC13D则定位于细胞质和细胞核中（图4f）。此外，Kaplan-Meier 曲线显示，与 S1 亚型相比，S2 亚型的 PFS 结果明显更差，S2 亚型的总生存期 (OS) 也呈现更差的趋势，表明亚型诊断模型可以准确预测 NPC 亚型（图4h-i）。

为了筛选NPC的新型治疗候选药物，他们分析了肿瘤组织和非肿瘤组织之间差异表达最显著的150个蛋白质（图1b）。他们将这些蛋白质特征映射到Connectivity Map（CMAP）数据库，并计算连接性评分，以筛选能够逆转肿瘤相关表达谱的化合物。优先筛选出具有高负连接性评分的化合物，最终得到20个候选药物（图5a）。这些药物涵盖了多种作用机制，包括组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂、富亮氨酸重复激酶（LRRK）抑制剂、APEX核酸酶抑制剂以及靶向mTOR、PI3K/AKT、MEK/MAPK、PLK1和IGF1R信号通路的药物。这些药物靶向关键的致癌通路，作用于表观遗传调控因子（HDAC亚型）、DNA损伤反应介质（LRRK2、APEX1）、代谢/增殖信号枢纽（mTOR、PI3K、MAPK）、有丝分裂调控因子（PLK1）以及生长因子受体（IGF1R）。为了验证这些化合物在鼻咽癌（NPC）中的疗效，他们排除了先前在NPC中研究过的药物、临床疗效不佳的药物以及作用机制不明的药物，最终筛选出三种候选药物：Droxinostat、KU-0063794和Panobinostat。Panobinostat和Droxinostat是广谱HDAC抑制剂，具有不同的治疗应用。Panobinostat通过转录调控和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，并已获得FDA批准用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤。相比之下，Droxinostat 已显示出对血液系统恶性肿瘤（例如 T 细胞淋巴瘤）的潜在治疗效果，其作用机制可能与表观遗传调控有关。KU-0063794是一种靶向 mTOR 通路的小分子抑制剂，可抑制癌细胞的增殖和代谢活性。临床前研究已证实其在多种实体瘤模型中具有抗肿瘤活性，但尚未进入临床开发阶段。

他们首先利用细胞活力检测评估了这些药物在两种鼻咽癌细胞系C666-1和HK1中的疗效。三种化合物均对两种细胞系的细胞增殖表现出显著的抑制作用（图5b）。克隆形成实验进一步证实了这些结果（图5c）。所有化合物均显著诱导细胞凋亡，其中Panobinostat在C666-1和HK1细胞系中均表现出最显著的促凋亡作用（图5d-e）。为了验证这些药物的体内疗效，他们将C666-1细胞皮下接种到雌性BALB/c裸鼠体内，随后进行药物给药。结果表明，三种药物均能有效抑制肿瘤生长，其中Panobinostat的抑制效果最为显著（图5f-g）。在另外两种NPC细胞系5-8F和HNE2中也证实了Panobinostat抑制细胞增殖的作用。此外，帕比司他显著抑制了NPC类器官的活力。

他们进一步寻找S2亚型特有的治疗靶点。基于S1和S2亚型之间的差异基因表达谱，他们对S2亚型进行了靶向药物预测（图5k）。筛选出的前20种候选治疗药物涵盖了多种作用机制，包括双特异性蛋白磷酸酶抑制剂、前列环素类似物、微管蛋白靶向药物和HDAC抑制剂。这些化合物靶向关键分子靶点，例如前列环素受体（PTGIR）、瞬时受体电位香草酸受体1（TRPV1）、polo样激酶1（PLK1）、HDAC1和鼠双微体2同源物（MDM2）。对于S1亚型，筛选出的前20种候选治疗药物包括CDK抑制剂、JNK抑制剂、MAPK抑制剂、AKT抑制剂、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂等（图S3i）。

鉴于S2亚型预后较差，他们进一步研究了预测的S2亚型抑制剂对不同鼻咽癌亚型的抑制作用。排除信息不明确的化合物后，筛选出五种候选化合物——曲前列尼尔、吴茱萸碱、灰黄霉素、GW-843682和依米丁——进行后续验证。首先检测了四种NPC细胞系（HK1、C666-1、5-8F和HNE2）中ACTBL2和UNC13D的蛋白表达水平。结果发现，ACTBL2和UNC13D在5-8F和HNE2细胞中高表达，而在HK1和C666-1细胞中几乎检测不到（图5k）。随后，他们研究了这五种化合物对这些细胞系细胞活力的影响，发现除曲前列尼尔外，其他四种化合物对5-8F和HNE2细胞的细胞毒性均高于HK1和C666-1细胞（图5l）。这些结果表明，基于ACTBL2/UNC13D的分子分型可能作为NPC个体化药物选择的潜在生物标志物。

Panobinostat在细胞和鼠肿瘤模型中均能显著抑制NPC的进展。接下来，他们探究Panobinostat发挥抗肿瘤作用的潜在机制。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类在染色质结构修饰和基因表达调控中发挥关键作用的酶。Panobinostat在低纳摩尔浓度下对所有纯化的I类、II类和IV类重组HDAC酶均表现出强效的抑制活性，其抗肿瘤作用主要通过表观遗传调控基因表达和抑制蛋白质代谢来实现。为了进一步研究其机制，他们对对照组和帕比司他处理的HK1细胞进行了转录组分析（RNA-seq）。Hallmark富集分析显示，Panobinostat处理显著下调了HK1细胞中E2F靶基因、G2/M期检查点调节因子以及MYC相关致癌通路等（图6a）。KEGG通路分析证实，Panobinostat可抑制细胞周期、DNA复制和同源重组（HR）修复机制等（图6b）。

DNA损伤会触发复制叉停滞，导致修复蛋白在这些位点积累。这一过程激活共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白激酶（ATR），ATR磷酸化并激活检查点激酶1（CHK1），诱导细胞周期阻滞以促进DNA修复。ATR还通过CHK1介导的BRCA1磷酸化激活RAD51，从而促进同源重组（HR）修复。在RNA-seq数据中，与对照细胞相比，Panobinostat处理的HK1细胞中ATR、CHEK1、RAD51和BRCA1的表达显著受到抑制，这在HK1和C666-1细胞的mRNA和蛋白水平上均得到了验证（图6c）。考虑到细胞周期会影响HR通路相关蛋白的表达，而这些蛋白通常在S/G2期高表达。为了确定Panobinostat是否通过调控细胞周期影响HR通路蛋白的表达水平，他们检测了Panobinostat处理的NPC细胞的细胞周期分布。结果显示，Panobinostat处理后，HK1和C666-1细胞均阻滞于S/G2期。因此，帕比司他下调HR通路分子并非由于其对细胞周期调控的影响。既往研究表明c-MYC调控HR相关基因的表达。因此，他们定量分析了Panobinostat处理后c-MYC的表达，观察到HK1和C666-1细胞中c-MYC mRNA和蛋白水平均显著降低（图6d）。随后，他们检测了MYC是否调控HR相关基因（包括ATR、CHEK1、RAD51和BRCA1）的表达。在HK1和C666-1细胞中敲低或过表达c-MYC均导致ATR、CHK1、RAD51和BRCA1的mRNA和蛋白水平发生相反的变化（图6e-f）。此外，c-MYC抑制剂MYCi975降低了ATR、CHK1、RAD51和BRCA1的mRNA和蛋白水平（图6g）。利用基于GFP报告基因的同源重组（HR）检测系统结合流式细胞分析，发现Panobinostat降低了HK1和C666-1细胞的HR修复效率（图6h），MYCi975也观察到类似的效果（图6i）。HR修复缺陷会导致DNA双链断裂（DSB），而γH2AX是公认的DSB生物标志物。因此，他们通过免疫印迹和免疫荧光分析检测到Panobinostat处理的细胞中γH2AX水平升高（图6j）。这一观察结果与先前报道的帕比司他可诱导癌细胞基因组不稳定的结论相符。鉴于DNA损伤与细胞凋亡之间已确立的联系，帕比司他显著诱导了细胞凋亡（图5d-e）。这些结果表明，Panobinostat通过抑制c-MYC及其下游靶基因（包括ATR、CHK1、RAD51和BRCA1）的表达来损害HR修复能力。通过抑制DNA损伤反应/HR修复通路的关键组分，Panobinostat加剧了NPC细胞中双链断裂（DSB）的积累并增强了细胞凋亡。

Panobinostat通过抑制HR修复促进DNA损伤的积累，这种表型可能使肿瘤对放射治疗更加敏感。与单药治疗相比，Panobinostat与电离辐射（IR）联合使用可显著提高HK1和C666-1细胞中的γH2AX水平并诱导细胞凋亡（图6k-l）。同样，在皮下异种移植小鼠模型中，与单独使用Panobinostat或电离辐射相比，Panobinostat与电离辐射联合使用可协同抑制肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量显著降低（图6m-o），而对体重无影响。这些发现建立了HR DNA损伤修复与帕比司他在NPC中放射增敏作用之间的机制联系。

本研究对NPC及非癌性鼻咽组织进行了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，以鉴定关键的异常表达蛋白和磷酸化网络。基于这些分析结果，将NPC分为两个不同的分子亚型：S1和S2，这两个亚型表现出显著的临床异质性。值得注意的是，S2亚型表现出更强的免疫抑制特征。通过整合来自癌组织和非癌组织以及两个分子亚型的蛋白质组学数据，本研究构建了稳健的诊断和预后模型。通过计算机辅助药物重定位和实验验证，Panobinostat是一种有效的NPC抗肿瘤药物，并在体外和体内模型中均显示出疗效。从机制上讲，Panobinostat通过抑制MYC表达，从而抑制HR修复通路中关键组分的转录激活。这种转录激活的降低会损害HR修复效率，并导致DSB的积累。此外，Panobinostat与放疗联合治疗产生了协同效应，显著增强了对NPC的抑制作用。总之，本研究鉴定了NPC的分子亚型，构建了初步的诊断和预后标志物组合，并观察了Panobinostat作为单药治疗以及与放疗联合治疗的治疗潜力。这些发现为NPC的精准诊断、预后分层和个体化治疗策略奠定了坚实的基础。