English文献解读|Signal Transduct Target Ther（40.8）：以约氏乳酸杆菌为靶点逆转慢性肾脏病
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论文ID
原名：Targeting Lactobacillus johnsonii to reverse chronic kidney disease
译名：以约氏乳酸杆菌为靶点逆转慢性肾脏病
期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影响因子：40.8
发表时间：2024.08.05
DOI号：10.1038/s41392-024-01913-1
背 景
慢性肾脏病 (CKD) 是一种全球性的、发病率和死亡率都很高的疾病，广泛影响着 15%-20% 的成年人口，尤其是高血压和糖尿病患者。越来越多的证据表明，肠道微生物失调与CKD的进展相互影响。然而，目前尚无有效的疗法可以抑制 CKD 的进展。
实验设计
结 果
01
微生物失调与 CKD 进展患者的肾功能衰退相关
本项研究纳入 400 例 CKD 患者，这些患者的病情可分为五个阶段（CKD1 = 81、CKD2 = 80、CKD3 = 79、CKD4 = 79、CKD5 = 81），并纳入 80 例年龄和性别匹配的健康对照。采集患者隔夜空腹血清、24 小时尿液和粪便样本，并进行16S rRNA 基因扩增子测序。反映物种丰富度的Chao和ACE指数与CKD进展呈正相关，Shannon指数与CKD2和CKD3期呈负相关，反映群落均匀度的Simpson指数与CKD3期呈正相关（图1a）。主坐标分析(PCoA)显示，CKD1和CKD2与健康对照未分离，而CKD3、CKD4和CKD5与健康对照和CKD早期阶段（包括CKD1和CKD2）分离（图1b）。值得注意的是，从CKD3到CKD5，CKD3、CKD4和CKD5显示出分离趋势（图1b）。基于线性判别分析效应大小，分支图显示CKD患者粪便中的菌群发生了改变（图1c），这些数据表明 CKD 患者存在微生物失调。
在门水平上，三种显著变化的细菌与肾小球滤过率(eGFR)、肌酐、尿素和胱抑素 C 相关（图1d），在纲到种水平上也观察到了类似的结果（图1e-f）。因此，这些结果表明，显著变化的细菌与 CKD 进展患者的肾功能下降有关。此外，从门到种，显著变化的细菌的丰度与红细胞、血红蛋白和血小板的变化相关（图1d-f），表明贫血与 CKD 患者的微生物失调有关。有趣的是，粪便中芽孢杆菌、乳酸杆菌目、乳酸杆菌科、乳酸杆菌属和约氏乳酸杆菌的丰度与 CKD 进展患者血清中的 eGFR 呈正相关，而与肌酐和胱抑素 C 水平呈负相关（图1d-f）。
图1. CKD 进展患者的微生物群落失调。
(a) 对照组和 CKD 五个阶段患者的 α 多样性。 (b) 基于对照组和 CKD 五个阶段患者的未加权 UniFrac 的 PCoA。(c) 基于线性判别分析效应大小，分支图展示了与 CKD 相关的进化关系的关键细菌。(d) 4种在门水平上显著改变的细菌与CKD患者25项生理生化指标之间的关联。(e) 在纲水平上显著改变的细菌与CKD患者25项生理生化指标之间的关联。(f) 在目水平上显著改变的细菌与CKD患者25项生理生化指标之间的关联。
乳酸杆菌科的丰度与 CKD 进展患者血清中的尿素水平呈负相关。Lactobacillus ruminis的丰度与 CKD 进展中的 eGFR 呈正相关（图2a）。与健康人群相比，在 CKD 患者的五个阶段中乳酸杆菌的丰度均显著降低（图2b）。进一步的结果显示，从健康对照、CKD 早期（CKD1 和 CKD2）、CKD 中期（CKD3）、CKD 终末期（CKD4 和 CKD5），乳酸杆菌的丰度呈现降低的趋势（图2c）。与健康对照组相比，两种乳酸杆菌属（包括L. johnsonii和L. ruminis）的丰度在 CKD 患者的五个阶段中均显著降低（图2c）。有趣的是，约氏乳酸杆菌(L. johnsonii)的丰度从健康对照到CKD早期到CKD终末期呈下降趋势（图2c）。这些数据提示约氏乳酸杆菌与肾功能有潜在联系。
图2. 乳酸杆菌丰度降低与 CKD 进展患者肾功能衰退相关。
(a) CKD 患者中 46 种显著变化的细菌与 25 种生理生化指标之间的关联。 (b) 对照组和 CKD 五个阶段患者的细菌在属水平上的分类分布。(c) 对照组和 CKD 五个阶段患者的不同乳酸杆菌的相对丰度。
02
在慢性肾功能衰竭大鼠中，约氏乳酸杆菌丰度降低与肾功能下降呈正相关
接下来，他们将进一步探索L. johnsonii减少是否与腺嘌呤诱导的慢性肾衰竭 (CRF) 大鼠的肾功能下降有关。结果显示，与对照组大鼠相比，CRF 大鼠的Simpson指数显著降低（图3a）。此外，主成分分析(PCA)和主PCoA结果均能将 CRF 大鼠与健康对照组大鼠区分开来（图3c）。厚壁菌门/拟杆菌门比率反映了粪便中整体微生物组成，在 CRF 大鼠中发生了显著改变（图3d）。与对照组相比，CRF 大鼠中多种乳酸杆菌的丰度显著下降，而Faecalibaculum rodentium的丰度显著增加（图3e），表明改变的乳酸杆菌与 CRF 大鼠病理进展有关。通过 41 种显著改变的细菌将CRF 大鼠与健康对照大鼠完全区分开来。细菌丰度与肌酐清除率(CCr)相关，表明过量的腺嘌呤对肠道菌群有关键影响。有趣的是，乳酸杆菌属及其五种菌种（包括L. johnsonii、L. acidophilus、L. intestinalis、L. murinus和L. animalis）丰度的显著降低与血清中肌酐、尿素和尿酸水平的升高呈负相关。这些结果表明，L. johnsonii的耗竭与 CRF 大鼠肾功能衰竭有关。
图3. 约氏乳酸杆菌丰度降低与肾功能衰竭呈正相关。
(a) 对照组和 CRF 大鼠在基因水平上的Simpson指数。(b) 基因水平上对照大鼠和CRF大鼠PCA和PCoA的变化。(c) 对照组和 CRF 大鼠的厚壁菌门/拟杆菌门比率。(d) 对照组和 CRF 大鼠在物种水平上 10 种显著差异细菌的丰度。(e) Spearman等级相关系数热图，显示 41 种不同水平的细菌与CRF 呈正或负相关的生理和生化指标相关。
03
补充约氏乳酸杆菌可延缓肾脏纤维化
在大鼠模型中，补充L. johnsonii可改善肾脏损伤和纤维化（图4a-c），同时抑制肾内促纤维化蛋白（包括 α-SMA、胶原蛋白 I 和纤连蛋白）的表达，并保持 CRF 大鼠的正常E-钙粘蛋白水平（图4d-e）。在结肠组织中，使用L. johnsonii处理可显著抑制 CRF 大鼠的闭锁小带蛋白(ZO1)、闭合蛋白(occludin)和紧密连接蛋白-1(claudin-1)的表达降低（图4f-g）。使用 barleriside A (BSA) 和 5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮 (HMF) 处理可显著提高 CRF 大鼠粪便中的L. johnsonii丰度（图4h）。这些发现表明L. johnsonii可改善肾功能和纤维化。因此，补充L. johnsonii可能是治疗 CKD 的一种有前景的方法。
图4. 补充约氏乳酸杆菌(LJI)可改善腺嘌呤诱导的 CRF 大鼠的肾脏纤维化。
(a) 对照组、CRF 组和LJI治疗组的 CRF 大鼠血清中的肌酐和尿素水平。(b) 对照组、CRF 组和LJI治疗组的 CRF 大鼠的 H&E 染色肾脏组织图像。(c) 对照组、CRF 组和LJI组的 CRF 大鼠的 Masson 三色染色肾脏组织图像。(d) 对照组、CRF 组和 LJI 组的 CRF 大鼠肾内胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的蛋白质水平。(e) 对照组、CRF 组和LJI治疗组的 CRF 大鼠肾内胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白水平的定量分析。(f) 对照组、CRF 组和LJI组 CRF 组大鼠结肠组织中 ZO1、occludin 和 claudin-1 蛋白的表达情况。(g) 对照组、CRF 组和LJI组 CRF 组大鼠结肠组织中 ZO1、occludin 和 claudin-1 表达情况的定量分析。(h) 用 BSA 和 HMF 治疗的腺嘌呤诱发的 CRF 大鼠粪便中LJI的丰度。
04
微生物产生的色氨酸代谢产生的吲哚衍生物在 CRF 大鼠中起着关键作用
他们接下来将进行代谢组学分析，基于UPLC-HDMS方法，他们分别在正离子和负离子模式下从CRF和对照组大鼠血清中获得了13251和21696个碎片离子。根据P值选择碎片离子，在正离子和负离子模式下，分别有2278和6030个碎片离子的P < 0.05（图5a）。PCA得分图显示2278和6030个碎片离子可以区分CRF组和对照组，这表明CRF大鼠的血清代谢模式发生了显著变化，他们鉴定出了314种代谢物。根据代谢物的化学结构，他们将314种代谢物进行了分类，结果显示代谢物主要包括102种氨基酸及其代谢物，78种脂质，24种碳水化合物，33种核苷，核苷酸及其衍生物和8种胺类。此外，其余30种代谢物无法归入特定的化学结构（图5b）。值得注意的是，含量最多的氨基酸及其衍生物主要包括40种色氨酸及其代谢物，以及10种甘氨酸衍生物，8种精氨酸衍生物和6种脯氨酸衍生物（图5c）。预z 分数结果显示，大多数代谢物水平在 CRF 大鼠中升高（图5d）。总之，血清代谢谱的改变与 CRF 大鼠中氨基酸及其衍生物的扰动有关。
为了研究血清色氨酸及其 39 种衍生物是否与血清肌酐水平相关，他们检测了 CRF 大鼠的色氨酸衍生物和肌酐之间的关联。在这些代谢物中，15 种代谢物的强度与血清肌酐水平显示出明显的相关性，相关系数超过 0.800（图5e）。其他 25 种代谢物与血清肌酐水平表现出较低的相关性。15 种代谢物中有 14 种属于吲哚衍生物，它们是微生物色氨酸代谢物。在CRF组和对照组之间，有15种代谢物的变量投影重要性(VIP)得分排名靠前，并且它们是重叠的（图5f）。在这15种代谢物中，吲哚-3-甲醛醛 (IAld)、犬尿喹啉酸、硫酸吲哚、5-甲氧基色氨酸、3-甲基吲哚、N-乙酰色氨酸、吲哚-3-乙酰胺和6-羟基硫酸褪黑素等8种代谢物与血清肌酐水平有显著相关性。除犬尿喹啉酸外，其他7种代谢物在结构上属于肠道菌群代谢色氨酸的吲哚衍生物。此外，ROC分析显示8种代谢物的曲线下面积(AUC)为0.89以上（图5g-h）。这些结果表明，CRF大鼠的肾脏纤维化与肠道微生物失调密切相关。
图5. 色氨酸吲哚代谢物的显著改变与腺嘌呤诱发的 CRF 大鼠的肾功能衰退有关。
(a) 以正离子和负离子模式呈现 CRF 大鼠与对照组大鼠每个变量的几何平均比。(b) 基于对照组和 CRF 大鼠的 314 种血清代谢物的饼图。(c) 基于对照组和 CRF 大鼠的 102 种氨基酸代谢物的饼图。(d) 对照组和 CRF 大鼠的 314 种代谢物的z分值图。(e) CRF大鼠的肌酐水平和色氨酸代谢物强度之间的关联。(f) 基于内置支持向量机的特征排序方法的线性支持向量机分类方法，以 VIP 分数呈现的顶级代谢物。(g) 基于PLS-DA 分析对照组和 CRF 大鼠肠道菌群对 4 种色氨酸代谢物的 ROC 曲线。(h) 基于 PLS- DA分析对照组和 CRF 大鼠宿主对 4 种色氨酸代谢物的 ROC 曲线。
05
色氨酸代谢产生的异常微生物衍生的吲哚衍生物与 CKD 患者有关
CKD 患者血清中 IAld 和 5-甲氧基色氨酸水平显著下降，而其他 7 种代谢物水平显著升高（图6a），与 CRF 大鼠的结果一致。八种色氨酸代谢物可以区分 CKD 患者和健康对照（图6b-c）。预测的类别概率显示 99.2% 的敏感性和 100% 的特异性（图6d）。此外，热图显示 CKD组和对照组的样品可以分开（图6e）。ROC 分析表明这八种代谢物显示出较高的 AUC 值以及较高的特异性和敏感性（图6f）。
图6. 来自色氨酸代谢的异常微生物衍生的吲哚衍生物与 CKD 患者有关。
(a) 小提琴图显示对照组和 CKD 患者中八种色氨酸代谢物的相对水平。(b) 来自80 名对照组和 120 名 CKD 患者的八种色氨酸代谢物的 PCA 得分图。(c) 来自80 名对照组和 120 名 CKD 患者的八种色氨酸代谢物的 OPLS-DA 得分图。(d) 基于支持向量机方法对八种色氨酸代谢物的诊断性能。(e) 对照组和 CKD 患者之间八种色氨酸代谢物的热图。(f) 基于PLS-DA 的对照组和 CKD 患者八种色氨酸代谢物的 ROC 曲线分析。
接下来，他们构建了单侧输尿管梗阻 (UUO) 和 5/6 肾切除术 (NX) 诱发的CKD大鼠模型。两种代谢物IAld和5-甲氧基色氨酸与eGFR呈现出很好的相关性，相关系数均超过0.800（图7a）。与假手术(sham)大鼠相比，NX大鼠的IAld和5-甲氧基色氨酸水平显著降低（图7b），且与NX大鼠血清肌酐水平呈显著相关性（图7c）。UUO和sham大鼠也显示出类似的结果（图7d-e）。腺嘌呤诱发组、NX和UUO组的大鼠粪便IAld和粪便中5-甲氧基色氨酸水平均略有降低（图7f-h）。CKD患者也显示出类似的结果（图7i）。这些数据表明血清IAld水平降低与CKD肾功能衰竭相关。
图7. CKD患者和大鼠模型中血清IAld水平降低与肾功能衰竭相关。
(a) CKD患者八种色氨酸代谢物水平与eGFR的关系。(b) Sham和NX大鼠血清IAld和5-甲氧基色氨酸水平的箱线图和点图组合。(c) NX大鼠肌酐水平与IAld和5-甲氧基色氨酸水平之间的关系。(d) Sham和UUO大鼠血清IAld和5-甲氧基色氨酸水平的箱线图和点图组合。(e) UUO 大鼠小管间质损伤评分与 IAld 和 5-甲氧基色氨酸水平的关系。(f) 对照组和 CRF 大鼠粪便中 IAld 和 5-甲氧基色氨酸的相对水平。(g) Sham 组和 NX 大鼠粪便中 IAld 和 5-甲氧基色氨酸的相对水平。(h) Sham组和 UUO 大鼠粪便中 IAld 和 5-甲氧基色氨酸的相对水平。(i) 健康对照组和 CKD 患者粪便中 IAld 和 5-甲氧基色氨酸的相对水平。
06
IAld和L. johnsonii通过抑制 AHR 信号来预防肾脏纤维化
两种剂量的IAld（50 mg/kg和100 mg/kg）治疗显著降低CRF大鼠的血清肌酐和尿素水平，同时升高CCr（图8a）。IAld改善肾脏损伤和纤维化（图8b-d），同时抑制肾内促纤维化蛋白的表达（图8e-f）。UUO大鼠也呈现出类似的结果（图8g-h）。越来越多的证据表明，许多色氨酸分解代谢物，如吲哚硫酸盐、IAld和IAA，是芳香烃受体(AHR)的配体，介导各种疾病中的AHR信号通路。两种剂量的IAld均显著抑制AHR及其下游四个基因的mRNA表达（图8i），同时显著抑制肾内AHR核易位（图8j）。进一步研究表明，IAld治疗显著抑制了CRF大鼠细胞核AHR蛋白表达的增加（图8k-l）。在UUO大鼠模型中也呈现出类似的结果（图8m-n）。总之，这些数据表明抑制AHR信号通路与IAld和LJI的肾脏保护作用有关。
图8. IAld 和L. johnsonii给药的肾脏保护作用与抑制 AHR 信号通路有关。
(a) 对照组、CRF 组和不同剂量 IAld 治疗的 CRF 大鼠的血清肌酐和尿素水平以及 CCr。(b) 大鼠的 H&E 染色肾脏组织图像。(c) Masson 三色染色肾脏组织图像。(d) 免疫组织化学分析。(e) 对照组、CRF 组和 IAld 治疗的 CRF 大鼠肾脏组织中胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的蛋白质表达。(f) 对照组、CRF 组和 IAld 治疗的 CRF 大鼠肾脏组织胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-cadherin 的定量分析。(g) Sham组、UUO 组和 IAld 治疗的 UUO 大鼠肾脏组织胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-cadherin 的蛋白表达情况。(h) 大鼠肾脏组织胶原蛋白 I、α-SMA、纤连蛋白和 E-cadherin 的定量分析。(i) 对照组、CRF 组和不同剂量 IAld 治疗的 CRF 大鼠肾脏组织AHR 及其靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的 mRNA 水平。(j) 对照组和 CRF 大鼠肾脏组织的抗 AHR 免疫组织化学分析。(k) 大鼠肾脏组织细胞质和细胞核中 AHR 蛋白的表达情况。(l) 对照组、 CRF 组和 IAld 治疗组的 CRF 大鼠肾脏组织细胞质和细胞核中 AHR 表达情况的定量分析。(m) 大鼠肾内AHR及其靶基因 CYP1A1 、 CYP1A2 、 CYP1B1 和 COX-2 的 mRNA 水平。(n) Sham 、 UUO和IAld治疗的UUO大鼠肾脏组织细胞质和细胞核中 AHR 蛋白的表达情况。
L. johnsonii治疗显著抑制了CRF大鼠肾脏组织中AHR及其下游四个基因的mRNA表达（图9a），同时抑制了肾内AHR核易位（图9b-c）。进一步研究表明，L. johnsonii治疗可抑制CRF大鼠细胞核AHR蛋白表达的增加（图9d-e）。此外，L. johnsonii治疗显著增加了CRF大鼠血清IAld水平，但没有影响粪便IAld水平（图9f-g）。这些数据表明L. johnsonii治疗抑制了AHR信号通路。在AHR敲除治疗的CRF小鼠中IAld抑制效果部分减弱（图9h-i）。
公开数据表明，在CKD患者中，内源性代谢物1-羟基芘(HP)通过AHR信号通路介导肾脏纤维化。两种浓度的IAld处理显著抑制了HP诱导的HK-2细胞中AHR及其下游四个靶基因的mRNA表达（图9j），同时显著抑制了AHR核易位（图9k-l）。同样，IAld处理抑制了HP诱导的HK-2细胞中促纤维化蛋白的表达并保留了E-cadherin蛋白的表达（图9n-o），AHR siRNA处理的HP诱导的HK-2细胞中IAld的抑制作用部分减轻（图9n-o）。总的来说，这些结果表明，微生物衍生的 IAld 通过减弱 AHR 信号改善肾功能并消除肾纤维化。
图9. IAld 通过抑制 AHR 信号通路防止肾脏纤维化。
(a) 大鼠肾内AHR及其靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的 mRNA 水平。(b) 免疫组织化学分析。(c) 免疫组织化学定量分析。(d) 对照组、CRF 组和LJI治疗组的 CRF 大鼠肾脏组织细胞质和细胞核中 AHR 蛋白的表达。(e) 对照组、CRF 组和LJI治疗的 CRF 大鼠肾脏组织细胞质和细胞核中 AHR 表达的定量分析。(f) 大鼠血清 IAld 相对强度。(g) 大鼠粪便 IAld 相对强度。(h) 各组肾脏组织 α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的蛋白表达。(i) 各组肾脏组织α -SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的定量分析。(j) 各组AHR及其靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的 mRNA 表达水平。(k) 各组 HK-2 细胞胞质和胞核中 AHR 的蛋白水平。(l) 各组 HK-2 细胞 AHR 的荧光素酶测定。(m) 所示组中 HK-2 细胞的 α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的蛋白质水平。(n) 所示组中 HK-2 细胞的 α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的蛋白质水平。(o) 所示组中 HK-2 细胞的 α-SMA、纤连蛋白和 E-钙粘蛋白的定量分析。
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结 论
本项研究分析 480 名参与者（包括健康对照者和 1-5 期 CKD 患者）的微生物组学，确定了一条与 CKD 进展患者相关的分类链：芽孢杆菌-乳酸杆菌目-乳酸杆菌科-乳酸杆菌属-约氏乳酸杆菌，其丰度与临床肾脏标志物密切相关。在腺嘌呤诱发的 CKD 大鼠中，约氏乳酸杆菌丰度随着 CKD 的进展而降低，补充约氏乳酸杆菌可改善肾脏病变。IAld水平与 CKD 大鼠的肌酐水平呈强烈负相关，但在UUO和NX诱发的大鼠以及晚期 CKD 患者的血清中均降低。在 CKD 或 UUO 大鼠以及培养的 1-羟基芘诱导的 HK-2 细胞中，IAld 治疗通过抑制AHR信号来减轻肾脏病变。在 AHR 缺失的小鼠和 HK-2 细胞中，IAld 的肾脏保护作用部分减弱。进一步的数据表明，用L. johnsonii治疗可通过增加血清 IAld 水平来抑制 AHR 信号，从而减轻肾脏病变。
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