文献解读|Nat Metab（20.8）：雄性小鼠肠道的代谢景观确定了由微生物活动决定的不同生态位

哺乳动物肠道的不同生态位充满了不同的微生物群，但空间变异对肠道代谢的作用仍不清楚。

为了系统地绘制肠道代谢组组成图，研究者团队在 15 个离散位置对 5 只雄性 SPF C57BL/6J 小鼠的整个肠道进行了采样（图S1a），并将肠腔内容物与肠黏液分离。为了量化肠道相关化合物，他们采用了液相色谱飞行时间质谱 (LC-TOF-MS) 工作流程，并建立了多种分析标准来量化肠道代谢组特征的 138 种代谢物，包括氨基酸和核苷酸代谢中的化合物、糖和其他碳源、胆汁酸和发酵产物（图S1b）。

对SPF的腔内含量和黏液的空间分辨分析使他们能够表征小鼠肠道的异质性代谢景观。对15个位置的代谢物剖面进行了内容层次聚类（图1a），为了便于比较，他们根据内容聚类对黏液谱进行了排序（图S1c）。胆汁酸、氨基酸及其衍生物在所有部位均可检测到，但具有明显的空间分布规律，以胃、小肠和大肠三个主要部位浓度最高。胃内容物以主要氨基酸的高浓度为特征（图1a）。产生蛋白质的氨基酸及其衍生物几乎只存在于小肠中。大肠聚类以有机酸、维生素和核苷酸代谢化合物为主。主成分分析(PCA)将小肠和大肠分开，主要由第一主成分上的氨基酸及其衍生物驱动，证实了两个区域之间的整体差异（图1b）。在大肠内，第二个主要成分进一步将肠腔内容物的代谢组谱与黏液分开。总体而言，以胆汁酸、碳源、氨基酸衍生物和有机酸作为分离驱动因素，管腔内容物中的代谢物浓度平均比黏液中的代谢物浓度高1.7倍（图1c）。只有亚精胺、肌酸和苹果酸在黏液中的含量明显高于管腔样品。高亚精胺浓度可能是微生物多胺产生的结果，这对于维持健康的黏液层很重要，特别是在大肠中（图1c，图S1d）。与多胺浓度较高一致，多胺前体精氨酸和鸟氨酸在大肠黏液中的浓度低于在肠管中的含量（图1d）。

图S1. 雄性 SPF 小鼠的生物地理学分析。

(a) 本研究中使用的 15 个采样点的示意图。(b) 使用本研究中使用的 LC-TOF-MS 方法。 (c) 雄性 SPF 小鼠肠道黏液代谢物丰度的层次聚类分析。(d) SPF 管腔内容物和大肠黏液样本中精氨酸、鸟氨酸和亚精胺的代谢浓度。

图1. 雄性 SPF 小鼠代谢组分析。

(a) 雄性 SPF 小鼠管腔内容物样本代谢物丰度的层次聚类分析。 (b) 基于覆盖整个肠道的所有 150 个管腔和黏液样本的个体雄性 SPF 小鼠的代谢物浓度的 PCA。 (c) 管腔内容物和黏液样本之间代谢物浓度的差异分析。

为了确定区分小肠和大肠的特定代谢物，他们分析了小肠和大肠中平均代谢物浓度的差异倍数，分别针对采样点和个体的肠腔内容物和黏液。这种差异分析揭示了小肠中氨基酸和相关代谢物的高浓度，特别是在黏液中（图2a-b）。组氨酸和色氨酸的浓度在整个小肠中始终较高，而在大肠中立即下降（图2c）。总体而言，31种代谢物在大肠的管腔内容物或黏液中的浓度至少是小肠的四倍，大肠的细菌负荷较高，表明其具有较高的微生物活性。短链脂肪酸（如丁酸/异丁酸）、糖分解产物（如甘油）和氨基酸降解产物（如4-羟基苯基乙酸酯）的急剧增加表明微生物进行了广泛的发酵（图2d）。尽管PCA没有区分肠道黏液内的区域（图1b），但差异分析显示，黏液中从氨基酸到发酵产物有明显的代谢变化，证实了小肠和大肠黏液之间的代谢差异（图2a-c）。

图2. 雄性 SPF 小鼠小肠和大肠之间的代谢组差异。

(a) 管腔（上）和黏液（下）中小肠和大肠样品之间代谢物浓度的差异分析。 (b) 小肠和大肠之间管腔和黏液中的代谢物发生显著变化。 (c-d) 组氨酸和色氨酸以及甘油酸和 4-羟基苯乙酸酯分别在 SPF 黏液或管腔中超过 15 个肠道位点的空间分布。

总体代谢组模式使他们无法区分小肠或大肠内的各个部位，因为预期这些部位的小鼠个体之间差异同样大（图1b），但约1/3的代谢物显示出不同的纵向轮廓（图3）。小肠中代谢物浓度的层次聚类产生三组：在十二指肠、空肠或回肠中浓度最高的代谢物。十二指肠中高浓度的代谢物包括果糖（图3a）和其他单糖，可能是在到达远端小肠之前被宿主吸收的残留膳食成分。空肠中的核黄素浓度最高，来源于微生物产生或残留的膳食维生素。回肠内容物中的高尿囊素浓度（图3a）可能是由于微生物降解了嗜粪小鼠小肠上部的嘌呤代谢物，这与十二指肠黏液中的高鸟嘌呤和鸟苷浓度一致（图3b），并且鸟嘌呤和鸟苷主要通过饮食流入。空肠黏液中的高肌酸浓度可能是饮食中肌酸的结果，而浓度降低可能是由于表达各种肌酸转运蛋白和肌酸代谢酶的高能量肠细胞摄取所致。在管腔含量中，尿嘧啶浓度在远端结肠中最高，而丁酸/异丁酸似乎在远端结肠中略微降低（图3c），在远端结肠中，丁酸是结肠细胞的主要能量来源。

在大肠黏液中，果糖分解产物甘油酸在盲肠达到峰值，但在结肠急剧下降。总之，这些数据表明，微生物活性可能是导致42种小肠代谢物纵向浓度谱的一个因素。

图3. 雄性 SPF 小鼠肠道的纵向代谢模式。

(a-c) 小肠内容物和黏液或大肠管腔内容物或黏液中具有不同浓度的代谢物的示例概况。

大肠中的高代谢物浓度（图2a）以其广泛的微生物活性而闻名，而小肠中的空间代谢物模式（图3）仅提供了微生物起源的间接证据。

小肠中较高浓度的氨基酸及其衍生物向大肠中维生素和发酵产物的普遍转变可能是由大肠中较高的微生物活性引起的，这表明 31 种微生物来源的代谢物。此外，他们还对42 种小肠内的实质性模式进行了量化。由于这些代谢差异至少部分是由肠道不同区域的微生物活动造成的，因此他们接下来研究了微生物群的作用。

在上述 31 种潜在微生物来源的代谢物中，有 24 种在 SPF 小鼠大肠中的平均浓度比无菌小鼠高至少四倍（图4a）。SPF 小鼠大肠中的短链脂肪酸丁酸/异丁酸和异戊酸/戊酸，以及次级胆汁酸石胆酸和猪脱氧胆酸的浓度至少高出 14 倍。如此高的浓度与众所周知的结肠内丰富的低氧和低 pH 耐受拟杆菌的形成一致。仅在 SPF 小鼠中检测到了生物素、3-丙酸吲哚和甘油，这为它们的微生物起源提供了有力的证据。3-丙酸吲哚是一种成熟的肠道微生物衍生化合物，由色氨酸代谢产生。

如前所述，普遍存在的细胞内代谢物 2-酮戊二酸的 SPF 浓度较高很可能是由于高细菌负荷所致（图4b）。新鉴定的微生物来源的代谢物是氢化肉桂酸、3-羟基丁酸、己酸、腺苷和岩藻糖/鼠李糖（图4c）。

同样，3-羟基丁酸和己酸也是发酵产物。糖如焦糖/鼠李糖很可能通过分泌的微生物糖苷水解酶从膳食纤维中释放出来。与之前的观察结果一致，无菌小鼠中较高的大肠肌酸和鸟苷浓度提示宿主或饮食来源（图4a）。

图4. 微生物群对大肠代谢的影响。

(a) 大肠浓度高于小肠浓度的 31 种代谢物丰度的差异倍数。 (b-c) SPF 中 2-酮戊二酸和氢化肉桂酸的大肠浓度以及无菌管腔内容物和黏液。

在小肠的特定位置，当分别考虑十二指肠、空肠和回肠时，SPF小鼠的8种管腔含量和2种黏液代谢物的浓度比无菌小鼠高4倍（图5a）。例如，嘌呤代谢终产物尿囊素的浓度在SPF小鼠的整个小肠中增加，在回肠中达到最大值，而无菌小鼠的浓度仍然很低（图5b）。在SPF小鼠中，膳食嘌呤代谢物鸟嘌呤、鸟苷和次黄嘌呤的浓度始终低于无菌小鼠（图5c），这为它们的微生物分解和随后转化为尿囊素提供了证据。肌酸的情况有所不同，其浓度最初在SPF小鼠和无菌小鼠的黏液中增加，但在无菌小鼠中降至基线，而在SPF小鼠的空肠中达到最大值（图5d）。

图5. 微生物群对小肠代谢的影响。

(a) 热图表示雄性 SPF 小鼠中代谢物的浓度比雄性无菌小鼠高至少四倍，特别是在小肠的一个位置与整个小肠。 (b) SPF 中尿囊素浓度和无菌管腔含量的空间分布。 (c) 小肠SPF中鸟嘌呤、鸟苷和次黄嘌呤的浓度以及无菌管腔内容物和黏液。(d) SPF 和无菌黏液中肌酸浓度的空间分布。

为了研究代谢组模式是否与微生物组组成相关，他们使用 16S 核糖体 RNA 测序技术，对同一窝共养的 5 只雄性 SPF 小鼠的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠进行了管腔含量和黏液群落组成分析。在所有五个位置，群落在门水平上以厚壁菌门为主，在科水平上以毛螺菌科、颤螺科、乳杆菌科和类杆菌科为主（图S6）。管腔含量与黏液在组成上的主要差异是管腔含量的多样性和Akkermansiaceae的相对丰度。

为了评估微生物对测量的肠道代谢组的作用，他们使用PICRUSt2工具确定了微生物组的功能潜力，该工具可预测每一种检测到的微生物的酶库。通过将获得的所有潜在微生物反应集与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中已知的小鼠代谢反应集进行比较，代谢物可分类为与宿主、微生物组或两者都有潜在联系（图6a）。为了确定生产物种，他们沿着SPF肠道对代谢物和微生物丰度进行了空间关联。总体而言，相关系数呈正态分布，620对代谢物-微生物对显著共现（图6b）。总的来说，他们预测了148对潜在的微生物代谢物的产生，从20种代谢物与91种微生物的丰度相关，包括14种不同的细菌目（图6c）。正如其普遍存在的性质所预期的那样，代谢中间体如N-乙酰谷氨酸和果糖分解产物甘油分别与41和22种微生物有关。

十种代谢物与三种或更少的微生物有更明确的联系，包括丁酸盐、鹅脱氧胆酸盐、鼠李糖和琥珀酸盐的单一微生物联系。他们分别确定了已知短链脂肪酸产生菌Lachnospiraceae和Lachnospiraceae NK4A136的成员（图6d）。

图S6. 雄性 SPF 管腔内容物和黏液的微生物组成。

男性 SPF 肠道内五个部位（十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）管腔含量（上）和黏液（下）的群落组成和差异。显示的是科水平上的相对微生物丰度（以百分比表示）。

图6. 代谢物-微生物关联。

(a) 维恩图显示了基于微生物代谢功能和小鼠代谢网络的 PICRUSt2 预测，分类为宿主或微生物相关的 128 个测量代谢物的重叠。 (b) 126336 个代谢物-微生物对的相关系数分布。(c) 桑基图，显示独特的代谢物和满足(b)中定义的阈值的正相关代谢物-微生物对中相应的微生物目。 (d) SPF 管腔样品中代谢物浓度和相关微生物的空间分布。

本项研究展示了健康定植和无菌雄性小鼠肠道的纵向代谢组图，揭示了从小肠中的氨基酸到大肠中的有机酸、维生素和核苷酸的总体转变。本项研究比较了定植小鼠与无菌小鼠的代谢情况，以探索不同生态位中许多代谢物的起源。除了饮食对小肠代谢生态位的已知影响之外，不同的空间模式表明微生物对小肠代谢组有特定的影响。因此，本项研究提出了肠道代谢图并确定了代谢物-微生物关联，这为将生物活性化合物的空间发生与宿主或微生物代谢联系起来提供了新的理论依据。

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