文献解读|Poultry Sci（4.014）：高、低精子活力的公鸡睾丸转录组分析

作者统计了79只公鸡的精液质量参数，得出平均精子活力为0.51±0.12，精子活力中位数为0.52，下四分位数和上四分位数分别为0.42和0.61（图1a）。精子活力的频率呈正态分布（图1b）。根据之前的研究，精子活力低于0.42低活力，高于0.61为高活力。基于以上数据，本研究选择了3只高精子活力的公鸡（0.74±0.03）和3只低精子活力的公鸡（0.24±0.02），分别采集睾丸组织进行后续实验。

图1. 公鸡精子质量（活力）参数

对6个文库（高精子活力组H1, H2, H3+低精子活力组L1, L2, L3）进行测序，得到的高质量reads分别为49673570、45968990、43805848、41691346、46183652和39461786；map ratio>92%，unique map ratio>96%。

本次测序，共鉴定了16837个mRNA，其中191个和195个分别在低精子活力组和高精子活力组中特异性表达（图2a）。共有140个差异表达mRNA，其中73个上调，67个下调（图2b）。其中，包括几个与精子发生和精子活力相关的基因，如KIFC1、REC8和DIO2（表2）。差异表达mRNA的聚类分析如图2c所示。

图2. 高、低精子活力的公鸡睾丸mRNA差异表达分析

表2. 精子发生和精子活力相关的差异表达基因

对差异表达mRNA进行功能富集分析以确定与精子活力相关的通路。结果表明，差异表达mRNA编码G蛋白偶联受体（GABBR2）、热休克蛋白（CRYAB和HSPB2）。其中，GABBR2显著下调，CRYAB和HSPB2显著上调（表3）。根据KEGG结果和已有的研究，认为和氧化磷酸化相关的基因（NDUFAB1、COX5A [下调]，MAOB [上调]）以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关的基因可能参与精子活力的调节（表4）。

表3. 最显著富集的GO通路

表4. 差异表达基因显著富集的前20个KEGG通路

为了验证测序结果的可靠性，随机选择9个差异表达基因（KCNK2, DIO2, HABP2, ANO8, CRYAB, KIFC1, OMP, TPPP3, KCNIP1），使用RT-qPCR进行验证（图3）。PCR结果表明：KCNK 2、DIO 2、HABP 2、ANO 8和CRYAB在高活力组中表达上调，而KIFC 1、OMP、TPPP 3和KCNIP 1在高活力组表达下调，与RNA-Seq结果一致。

图3. RNA-Seq和RT-qPCR结果之间的一致性

使用PLEK、CNCI和PfamScan鉴定LncRNA，并选择了7830个LncRNA用于后续分析。为了评估mRNA水平对精子活力的影响，整合了两个组之间的差异表达LncRNA。和LncRNA相比，mRNA序列更长（图4a），数目更多（图4 b）。大多数LncRNA含有2或3个外显子，而大多数mRNA具有10个以上的外显子（图4c）。共有7400个LncRNA在高和低活力精子组中共表达。其中，227和202分别在低活力和高活力组中特异性表达（图4d）。共有103个差异表达的LncRNA，其中56个下调，47个上调（图4 e）。根据差异倍数的变化，LncRNA分为2组（图4f）。

图4. 高、低精子活力的公鸡睾丸LncRNA差异表达分析

为了进一步研究LncRNA及其靶基因对精子运动的调控作用，对15895个顺式调控基因和3000个反式调控基因进行了功能富集分析，发现差异表达基因与生长发育、生殖、免疫和代谢等功能密切相关（图5a），并且在mTOR信号传导通路、VEGF信号传导通路、磷脂酰肌醇信号传导通路、RNA转运和氨酰tRNA生物合成通路中显著富集（图5b）。

图5. 顺式和反式调节基因的功能注释和富集分析

使用R中的Igraph软件包分析LncRNA和mRNA之间的相互作用（图6）。7个顺式调控基因与7个LncRNA相互作用。基因HBBA、TET2和SH3TC1下调，而C1QL1、LOC112530336、LOC100858942和LOC112531346上调（图6a）。13个反式调节基因与12个LncRNA相互作用。基因LRRC74A、BORCS6、TPPP3、TEF、LOC112530178、CHST12和ZNF692下调，而LOC101749307、LOC107054355、MROH7L4、CRYAB、REC8和VWC2上调（图6b）。REC8抑制MSTRG.15920.1和MSTRG.11860.2，而VWC2抑制MSTRG.11860.2。研究表明，REC8影响精子减数分裂，VWC2是骨形态发生蛋白拮抗剂，BMP4促进鸡原生殖细胞的形成。

图6. LncRNA-mRNA相互作用网络以及RT-qPCR和RNA-Seq结果之间的一致性。

注：方框代表LncRNA，椭圆代表靶基因，绿色表达下调，红色代表上调。