文献解读|Cell Rep Med（14.3）：肿瘤内微生物组衍生的丁酸盐促进肺癌转移

肺癌(LC)是全球癌症相关死亡率最高的癌症，大多数LC复发发生在术后3年内，但其潜在机制仍不清楚。

为了探讨肿瘤内肺肿瘤微生物组组成与肺癌复发的关系，研究团队首先建立了一个早期肺癌队列，包括手术后3年内复发的患者（复发[R]组，中位无复发生存期(RFS)为1.3年）和临床分期匹配的3年以上无复发的长期幸存者（非复发[NR]组，中位RFS为4.9年）（图S1A）。R组和NR组患者在年龄、性别、身体质量指数(BMI)、吸烟史、临床分期、肿瘤直径和病理方面进行匹配。此外，R组患者的TNM分期比NR组更早，这与肿瘤复发的特点是一致的。从58例手术切除的肺癌肿瘤和邻近正常肺组织（29例R和29例NR）中提取细菌DNA，并通过16S rRNA基因测序进行分类分析（图S1B）。他们首先使用不同的方法（Shannon和Simpson指数）检测肿瘤微生物多样性，发现肿瘤微生物组的α多样性（定义为每个肿瘤样本中存在的物种的丰度和多样性）在NR患者中明显高于R患者（图1A）。同样，与R患者相比，NR患者正常肺微生物组的α多样性更高（图S1C）。然后，他们根据Shannon指数得到的中位数多样性对两组患者进行分层，探讨肺癌肿瘤微生物多样性与RFS的关系。正如预期的那样，他们发现低α多样性的患者与高α多样性的患者相比，RFS显著降低（图1B）。这些研究结果表明，肿瘤α多样性可以作为切除肺癌患者RFS的预测因子，提示肿瘤内微生物组可能参与肺癌复发。

为了进一步了解微生物组多样性的作用及其与复发的关系，他们使用微生物β多样性比较了R组和NR组肿瘤中总体微生物组组成。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示R组和NR组之间存在明显的聚类差异（图1C）。采用相似性分析(ANOSIM)来评估微生物组组成之间的统计学差异，发现R组和NR组的总体肿瘤微生物组组成有显著差异（图1C）。此外，在正常肺组织中，R组和NR组之间的总体微生物组组成也存在类似的差异（图S1D）。

鉴于肺癌患者多样性与 RFS 之间的关系，他们接下来试图确定 R 和 NR 患者之间微生物群落的差异。在门水平上，无论是肿瘤组织还是正常肺组织，R组和NR组的主要组成为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门（图2A，图S1E）。此外，与NR患者相比，R患者的肿瘤和正常组织中厚壁菌门的比例增加，但变形菌门和放线菌门的比例减少（图2B，图S1F）。在属水平上，Faecalibacter、Roseburia、Blautia和Bifidobacteria在两组中都显示出相对较高的丰度（图 2 A ，图S1 G）。与NR组相比，R组中Roseburia和Blautia的比例增加，而Faecalibacter和Bifidobacteria的比例减少（图2A，图S1H）。

为了进一步识别R组和NR组之间的差异微生物群并找到潜在的微生物生物标志物，他们在属水平上进行了效应大小(LEfSe)的线性判别分析。在肿瘤组织中，LEfSe 揭示了可区分 R 组和 NR 组的 22 个特征（图 2 C）。Roseburia是R组最明显的生物标志物。RT-PCR检测证实，R组Roseburia含量更高（图S1L）。双歧杆菌、幽门螺杆菌和Akkermansia是NR组的生物标志物。使用Lasso回归模型进行进一步选择，他们发现6个属（Roseburia, Helicobacter、Gardnerella、Flavonifractor、Coprococcus和Anaerostipes）可能作为区分R和NR组的潜在生物标志物，这6个属与RFS呈显著相关（图2D）。这6个属的相对丰度在R组和NR组之间存在显著差异（图2E）。根据中位预测评分将患者分为高危组和低危组。Kaplan-Meier生存曲线显示，高危组RFS明显缩短（图2F）。重要的是，在调整TNM分期后，属预测评分仍然是多变量Cox回归模型中RFS的独立预测因子。属预测评分的曲线下面积(AUC)值为0.887（图2G）。

近年来，循环微生物组 DNA(cmDNA)作为一种很有前景的生物标志物出现在癌症诊断中。因此，他们招募了另一个队列来探讨cmDNA与肺癌复发的关系（图3A）。共招募了63名肺癌患者，并通过全基因组测序对其血浆进行了测序。R组和NR组患者在年龄、性别、BMI、吸烟史和病理方面没有差异。在属水平上，两组中不动杆菌、Cutibacterium、丛毛单胞菌和葡萄球菌的丰度相对较高（图S3A）。正如预期的那样，他们在R和NR患者的血浆和肿瘤组织中发现了22个共有属，其中包括幽门螺杆菌和加德纳菌，它们是肿瘤组织中的生物标志物（图3B）。在一定程度上与肿瘤组织一致，NR患者的cmDNA α多样性高于R患者，但无统计学差异（图3C）。此外，使用Bray-Curtis距离的PCoA显示R组和NR组之间的cmDNA存在差异（图3D）。

然后将患者随机分为发现组(70%)和验证组(30%)，用于模型校准和验证（图3A）。使用MaAslin2发现7个具有预测概率的属。R组富集了克雷伯氏菌(Klebsiella)、马氏菌(Massilia)和微球菌(Microbulbifer)， NR组富集了Cutibacterium、丛毛单胞菌、葡萄球菌和ophilus（图S3B-C）。主成分分析(PCA)表明，这7个属在R组和NR组之间存在明显的聚类差异（图3E，图S3D）。基于这7个属构建随机森林模型，发现集的AUC达到0.857（图3F）。他们使用验证集进一步评估模型并达到可接受的预测能力（AUC = 0.717）（图3F）。此外，他们还发现包括葡萄球菌(Staphylococcus)、Massilia和克雷伯菌(Klebsiella)在内的属与RFS显著相关（图3G）。这些结果表明，cmDNA标记是在手术前预测早期肺癌复发的有希望的非侵入性生物标志物。

鉴于R组中肿瘤和正常组织中产生丁酸的细菌，尤其是Roseburia ，均富集，他们进一步探讨了Roseburia是否可以促进肺癌进展。利用BLAST分析，他们发现Roseburia的序列与Roseburia testinalis的序列最接近，并选择该序列进行进一步的实验。皮下移植肺癌小鼠瘤内每3天注射一次R. intestinalis（Roseburia组）或PBS，在小鼠皮下异种移植物中引入R. intestinalis可使肿瘤体积增大（图4A）。

R组多种产丁酸菌如Roseburia和Butyricicoccus受到干扰，提示丁酸盐可能在肿瘤复发和转移中起作用。以往的研究表明，丁酸盐可能在肠道中发挥不同的作用。丁酸盐在其他器官中的浓度相对较低，可能促进前列腺癌的肿瘤细胞增殖。探讨丁酸盐浓度对肺癌细胞增殖的影响。CCK8实验和集落形成实验显示，低浓度(1 mM)丁酸盐可促进肺癌细胞增殖，高浓度(5 mM)丁酸盐可抑制肺癌细胞增殖（图4B-C）。因此，他们重点研究了低浓度丁酸盐对肺癌细胞迁移和侵袭的影响，发现丁酸盐能促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力（图4D-E）。利用肺腺癌患者源性类器官(PDO)，他们发现添加丁酸盐可以促进类器官中侵袭性链(invasive strands)的产生，表明丁酸盐可以促进肺癌类器官的侵袭能力（图4F）。

为了进一步评估丁酸盐在体内的功能，他们通过注射加丁酸盐(1 mM)或不加丁酸盐(1 mM)预处理的Lewis肺癌(LLC)细胞，建立C57BL/6J小鼠原位肺癌模型。与阴性对照组相比，丁酸组肺原位肿瘤体积明显增加（图4G）。他们建立了C57BL/6小鼠LLC尾静脉转移模型。小鼠用雾化的万古霉素(10 mg/mL)和新霉素(20 mg/mL)处理一周，以减少共生肺微生物群的干扰。然后，小鼠经尾静脉注射LLC细胞，并雾化生理盐水或丁酸盐（40或200 mM）。低浓度丁酸组(40 mM)肺转移灶数高于生理盐水组，但差异无统计学意义（图4H）。

这些结果提示低浓度丁酸盐可促进肺癌细胞的迁移、侵袭和转移。

为了进一步探讨丁酸盐在肺癌进展中的潜在机制，他们对用或不用丁酸盐 (1 mM) 处理的 A549 细胞进行转录组分析(RNA-seq)。差异表达基因(DEG)分析显示丁酸盐组中有 2680 个上调基因和 656 个下调基因（图 5 A）。然后，他们使用丁酸盐处理后上调的基因生成基因特征，并根据无病生存率（DFS；＜或＞3年）在TCGA数据集中对肺癌癌症患者进行分类。进行基因集富集分析，丁酸上调的基因特征在DFS＜3年的患者中显著富集（图5B）。他们进一步根据细胞内表达情况筛选上调基因，最终得到438个上调基因，其中H19上调最为显著（图5A）。在A549和H1299细胞系中，他们发现丁酸盐能显著提高H19的表达（图5C）。H19是一种长链非编码RNA，在包括肺癌在内的多种肿瘤的进展和转移中发挥重要作用。

既往研究报道组蛋白去乙酰化酶2 (histone deacetylase 2, HDAC2)可通过H3K27去乙酰化抑制H19的表达，抑制肿瘤转移，丁酸盐可抑制HDAC2。因此，他们推测丁酸盐可能通过调节HDAC2和H3K27乙酰化而增加H19的表达。在A549细胞中，他们发现丁酸盐可以在mRNA和蛋白水平上抑制HDAC2的表达（图5D-E）。通过丁酸抑制HDAC2可促进组蛋白H3K27乙酰化（图5E）。染色质免疫沉淀实验证实HDAC2可以结合H19启动子，丁酸盐处理可以抑制这种结合（图5F）。通过丁酸盐抑制HDAC2可增加H19启动子上H3K27乙酰化水平（图5G）。

由于H19是一种没有蛋白产物的非编码RNA，因此我他们进一步探索了H19的下游靶点。大量证据表明，H19可以促进多种基质金属蛋白酶(MMP)的表达。RNA-seq数据显示，MMP15在丁酸盐组中显著上调（图5A）。此外，患者来源类器官(PDO)实验也证实丁酸盐处理诱导了更多的MMP15分泌（图5H）。据报道，MMP15参与肝癌、非小细胞肺癌等肿瘤的转移。免疫组化结果显示，R组肿瘤组织中MMP15的表达明显升高（图5I）。他们还发现，通过TCGA数据集，MMP15的高表达与非小细胞肺癌TNM晚期和短RFS相关。在A549或H1299细胞中，丁酸盐可以在mRNA和蛋白水平上显著提高MMP15的表达。相反，沉默H19可抑制A549和H1299细胞中MMP15的表达。

他们设计了功能挽救实验，用低浓度丁酸盐处理A549或H1299细胞，然后沉默细胞中的H19（图5L）。伤口愈合实验表明，低浓度丁酸盐促进了肺癌细胞的迁移，并且丁酸盐处理所带来的迁移优势由H19沉默部分逆转。这些结果提示，低浓度丁酸盐可能抑制HDAC2及其与H19启动子区域的结合，从而提高H19启动子区域H3K27乙酰化水平，进一步提高H19的表达，促进肺癌细胞的进展。

丁酸盐可以调节免疫细胞的分化，例如调节性T细胞和巨噬细胞。而肿瘤微环境中的M2巨噬细胞可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移，他们推测低浓度丁酸可能促进巨噬细胞从M0极化到M2，从而促进肿瘤转移。骨髓源性巨噬细胞(BMDM)或RAW264.7细胞经白细胞介素-4 (IL-4)处理后极化为M2表型（M2组为后续实验中经IL-4处理的巨噬细胞），然后用不同浓度的丁酸盐处理M2（图6A）。IL-4成功诱导M2极化，在BMDM或RAW264.7细胞中，Arg1、Ym1和Fizz1的表达增加（图6A）。在BMDM细胞中，暴露于0.5 mM丁酸盐24 h的m2 -BMDM细胞中，Arg1、Fizz1和Ym1的相对表达量显著升高（图6A）。在BMDM和RAW264.7细胞中，对Arg1的影响最为显著。Western blot分析证实，丁酸盐处理后Arg1蛋白表达增强（图6B）。在尾静脉转移模型中，免疫组化显示低浓度丁酸组肺转移灶中Arg1的表达明显高于其他两组（图6C）。此外，ARG1和CD206共染色也显示R患者肿瘤组织中存在更多的M2巨噬细胞（图6D）。综上所述，这些数据表明丁酸盐促进M2巨噬细胞极化。

研究表明，M2巨噬细胞通过分泌多种细胞因子，如IL-10和IL-13，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。收集经丁酸处理和未经丁酸处理的M2巨噬细胞培养基(CM)上清，用Quantibody小鼠细胞因子阵列进行分析。结果显示，经丁酸处理的M2巨噬细胞的CM含有更多的IL-10、IL-13和MIP3a，这些物质与肿瘤转移有关（图6E）。因此，丁酸盐处理M2-BMDM后，M2-BMDM中CM的迁移和侵袭促进作用显著增强（图6F-G）。为了进一步证实巨噬细胞是否参与体内丁酸盐诱导的转移，他们建立了LLC尾静脉转移模型，并通过氯膦酸脂质体消耗巨噬细胞（图6H）。与对照脂质体相比，氯膦酸盐脂质体处理显著减少了外周血和肝脏中的巨噬细胞（图6I），去除巨噬细胞减弱了丁酸盐的促转移功能（图6J）。综上所述，这些数据表明巨噬细胞参与了丁酸盐促进转移的功能。

本项研究发现复发组的瘤内微生物组多样性较低，并且复发组的丁酸产生菌富集。肿瘤内微生物组特征和循环微生物组 DNA 可以准确预测 LC 复发。瘤内注射产生丁酸的细菌Roseburia可以促进皮下肿瘤的生长。从机制上讲，细菌来源的丁酸盐通过抑制 HDAC2 和增加 H19 启动子处的 H3K27 乙酰化并诱导 M2 巨噬细胞极化来增加肿瘤细胞中 H19 的表达，从而促进 LC 转移。巨噬细胞的消耗部分消除了丁酸盐的促进转移作用。本项研究结果为肿瘤内微生物组和 LC 转移之间的相互作用提供了理论依据，并表明肿瘤内微生物组的潜在预后和治疗价值。

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