文献解读|Cell Rep Med（14.3）：从浸润前到浸润性肺腺癌的进化蛋白质组景观

肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因。随着低剂量计算机断层扫描(LDCT)筛查的广泛应用，早期肺腺癌的检出率不断提高，这主要是由于原位腺癌(AIS)和微创腺癌(MIA)病例的增加。AIS定义为局限性小(≤3cm)腺癌，其生长局限于肿瘤细胞沿原有肺泡结构生长，无侵袭性，而MIA是一种小腺癌(≤3cm)，以鳞状形态为主，在任何一个病灶的最大尺寸上浸润≤5mm。病理上，肺腺癌通常是从AIS/MIA逐步发展为侵袭性病变。AIS和MIA都属于肺腺癌的侵袭前阶段，而侵袭性腺癌(IAC)代表侵袭期。因此，确定从AIS/MIA到IAC进展的分子结构和标志至关重要。

研究团队收集了来自东亚患者的 197 个肺部肿瘤和配对的正常邻近组织 (NAT)，其中包括 98 个 AIS/MIA 和 99 个 IAC（图 1 A）。AIS 和 MIA 亚型之间没有观察到明显的差异，因此将AIS/MIA 亚型在本研究中分为一组。他们进行了综合分析包括全外显子组测序(WES)、转录组分析(RNA-seq)以及蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析（图1A）。对比分析显示，在AIS/MIA组（图1B-E）以及复旦队列和其他研究中检测到较低的肿瘤突变负荷(TMB)。此外，排名第一的EGFR突变早在AIS/MIA亚型中就检测到，并持续到IAC亚型（图1C），表明EGFR突变是肺癌进展早期的关键事件。

在 AIS/MIA 队列中总共鉴定出 11708 个蛋白质，在 IAC 队列中检测到 19629 个蛋白质（图1F-G）。值得注意的是，与配对的正常组织相比，在肿瘤组织中检测到更多的蛋白质和磷蛋白位点（图1F-G）。

图1. AIS/MIA 和 IAC 队列的蛋白质组学概述。

(A)AIS/MIA 和 IAC 队列的蛋白质组学概述。(B) 按肿瘤侵袭程度分层的前 10 个变异基因。(C) Lollipop图显示了复旦队列（所有肿瘤）以及 AIS/MIA 和 IAC 队列中EGFR突变的详细信息。(D) 复旦队列和其他公共队列中的肿瘤突变负担。(E) AIS/MIA 和 IAC 中的基因突变数量（左）和肿瘤大小（右）。(F)在 AIS/MIA 队列的正常组织和肿瘤中鉴定出累积蛋白质数量（左）和绝对蛋白质数量（右）。(G) 在 IAC 队列的正常组织和肿瘤中鉴定出累积蛋白质数量（左）和绝对蛋白质数量（右）。

拷贝数改变(CNA)在肿瘤进展过程中发挥着关键作用，因此他们进一步研究了与生存结果相关的缺失峰。chr4q12 和 chr5q21.1 的缺失是与临床结果相关的两个主要改变（图2A-B）。仅在 IAC 中检测到 chr4q12 缺失，表明在 chr4q12 缺失期间发生了关键的分子事件（图2B）。为了研究 chr4q12 和 chr5q21.1 缺失的生物学效应，他们对在蛋白质和 RNA 水平上表现出体细胞 CNA (SCNA)顺式调节效应以及从 AIS/MIA 下调至 IAC 的基因进行了研究。为此，仅在两个水平上鉴定了精子发生相关蛋白 18（SPATA18，也称为Mieap）（图 2D），并显示出对其对应蛋白的顺式影响（图 2E）。与AIS/MIA相比，IAC中SPATA18的RNA和蛋白水平表达较低（图2F）。此外，SPATA18缺失事件和 SPATA18 蛋白低表达与较差的总生存期 (OS) 相关（图2G-H）。

SPATA18是一种新的p53诱导蛋白，影响线粒体的生物学功能。SPATA18能够诱导溶酶体样细胞器消除氧化的线粒体蛋白，这对线粒体质量控制至关重要。本项研究分析表明，SPATA18缺失与溶酶体样细胞器标记下调以及线粒体膜分子和氧化磷酸化(OXPHOS)上调有关（图2I）。下调SPATA18可显著促进细胞生长和细胞周期（图2J-K）。迁移和侵袭是肿瘤细胞脱离原发肿瘤部位，浸润淋巴和血管，最终促进肿瘤进展的关键步骤。

鉴于SPATA18在AIS/MIA向IAC进展中的潜在作用，他们进行了伤口愈合、迁移和侵袭试验。结果表明，下调SPATA18可增强肺腺癌的迁移和侵袭能力（图2L-M）。

接下来，他们研究了SPATA18对线粒体自噬的影响。转染两个靶向SPATA18的短发夹rna (shRNA)后，观察到LysoSensor的荧光密度显著降低，MitoTracker的荧光密度升高（图2N）。这些发现共同表明，线粒体自噬的抑制是SPATA18下调的结果。动物实验也证实了下调SPATA18的促肿瘤作用（图2O）。综上所述，chr4q12缺失可能是AIS/MIA向IAC过渡过程中的关键事件，其中SPATA18缺失通过抑制线粒体自噬来促进肿瘤生长（图2P）。

图2. 与从 AIS/MIA 到 IAC 进展相关的CNA。

(A) 与肺腺癌患者的生存相关的缺失峰。(B) AIS/MIA 和 IAC中两个最显著缺失峰（chr5q21.1 和 chr4q12 缺失）的分布。(C) 按 chr4q12 缺失分层的总生存期 (OS)。(D) CNA-蛋白和 CNA-RNA 的相关性。(E) SPATA18缺失与蛋白质水平表达之间的关联。(F) AIS/MIA 和 IAC 中 SPATA18 蛋白和 RNA 表达的比较。(G) 按SPATA18缺失进行分层的 OS。(H)按 SPATA18 蛋白水平分层的 OS。(I) 热图可视化SPATA18缺失与溶酶体样细胞器和线粒体标记相关基因之间的相关性。(J) 在用 shSPATA18 或 shNC 转染的 A549 中通过 CCK-8 测定进行细胞增殖分析。(K) 在用 shSPATA18 或 shNC 转染的 A549 中进行细胞周期分析。(L) 下调 SPATA18 对伤口愈合的影响。(M) 下调 SPATA18 对迁移和侵袭的影响。(N) 转染过表达 SPATA18 或 shSPATA18 的 A549 中 LysoSensor 和 MitoTracker 的免疫荧光图像。(O) SPATA18对裸鼠A549细胞异种移植的影响。(P) 该图显示了 chr4q12 缺失、SPATA18 下调、线粒体自噬减少和肿瘤生长之间的关联。

主成分分析(PCA)显示了正常肺组织、AIS/MIA和IAC在RNA和蛋白质水平上的差异谱（图3A），显示了不同阶段肺癌进展的内在差异。

为了探讨肺腺癌发生发展的分子特征，他们进行了基因集富集分析(GSEA)（图3B-C）。正常肺组织主要与细胞粘附、氧运输和类维生素a代谢过程相关（图3B）。其中，正常肺组织中LAMC2、CDH5等高表达蛋白与肺癌患者预后呈正相关（图3D）。AIS/MIA在凝血、补体活化、细胞溶解和脂肪酸β-氧化方面有上调的特征（图3B-C）。在IAC中，主要通路包括MAPK级联、小gtpase介导的信号转导、细胞周期、NIK/NF-κB信号转导、ephrin受体信号转导通路、FGFR信号转导通路和脂肪酸生物合成过程（图3B-C）。同时，AIS/MIA-和iac -富集蛋白均与肺腺癌患者预后较差相关，包括CFB、C2（来自补体活化）、MCM2、YWHAB（来自细胞周期）、TIAL1和GRB2（来自FGFR信号传导）（图3D）。

为了了解EGFR突变在肿瘤发生和进展中的影响，他们随后研究了与EGFR突变相关的显著失调标志。GSEA结果显示，EGFR突变患者与柠檬酸循环(TCA)和NOTCH信号通路相关的蛋白显著富集（图3E-F）。在RNA水平上也观察到类似的趋势（图3F）。从其他三个数据集也检测到EGFR突变组中NOTCH信号的更高富集分数。NOTCH信号的关键调控蛋白NOTCH1对肺腺癌患者的生存有负面影响（图3G）。总的来说，这些结果显示了EGFR突变的下游蛋白质组学特征（图3H）。

图3. 正常组织、AIS/MIA 和 IAC 的蛋白质组特征。

(A) 正常组织、AIS/MIA 和 IAC 中蛋白质组数据的主成分分析 (PCA)。 (B) 使用正常组织、AIS/MIA 和 IAC 中的蛋白质组数据绘制的富集通路热图。(C) 属于补体激活和 MAPK 级联的基因中的蛋白质水平和 RNA水平。(D)按细胞粘附、补体激活、细胞周期和 FGFR 信号转导相关基因的蛋白质水平分层的OS。(E) 基于按EGFR突变状态分层的蛋白质组数据的基因集富集分析 (GSEA)。(F) 按EGFR突变状态分层的与 NOTCH 信号通路和TCA 循环相关的基因的 RNA 和蛋白质表达水平。(G)按 NOTCH1（NOTCH 信号通路的关键分子）的蛋白质水平分层的 OS。(H) 显示EGFR突变和改变的通路之间相互作用的网络模型。

细胞外基质(ECM)受体相互作用、补体和凝血级联以及内吞作用在egfr突变型AIS/MIA中富集（图4A-B）。当疾病阶段进展到IAC时，典型的EGFR下游信号通路发生激活，如PI3K-Akt、MAPK和mTOR信号通路（图4A-B）。随后，他们比较了两组之间的激酶丰度。AIS/MIA具有较高的MAPK7表达，而IAC与CSNK2A1和MTOR过表达相关（图4C）。随着病情进展到IAC期，DNA复制和自噬发生激活（图4D），相关磷酸化蛋白（如SSB_S366和ULK1_S638）与肺癌患者的预后呈负相关（图4E）。

总的来说，EGFR突变在 AIS/MIA 和 IAC 中发挥着不同的作用（图 4F）。

图4. 从EGFR突变体 AIS/MIA 到EGFR突变体 IAC 的蛋白质组学表征。

(A) 在EGFR突变背景下，使用 AIS/MIA 和 IAC 中的蛋白质组数据绘制富集通路的热图。(B) AIS/MIA 和 IAC 中与EGFR突变相关的失调通路概述。(C) EGFR突变体 AIS/MIA 和 IAC 中具有异常表达的蛋白激酶。(D) 上调激酶的蛋白质水平及其下游磷酸化位点。(E)按 SSB_S366 和 ULK1_S638 磷酸化水平分层的OS。(F) 描述 EGFR 突变在 AIS/MIA 和 IAC 中的不同作用的模型。

他们进行共识聚类来分类蛋白质组亚型，并鉴定了三种亚型（SI、S-II、S-III）（图 5 A）。分类为 S-III 的患者表现出较差的 RFS 和 OS，而分类为 SI 的患者则表现出改善的 RFS 和 OS（图5B）。

他们进一步进行亚型特异性通路富集，以揭示三个亚组之间的不同分子特征。细胞外基质组织、细胞粘附、蛋白水解、白细胞迁移和中性粒细胞脱颗粒在 SI 中富集（图 5C-D）。S-II 主要与细胞外基质组织、细胞粘附、白细胞迁移、中性粒细胞脱粒、Rho 蛋白信号转导、LDL 颗粒介导的信号传导和补体激活的负调节相关（图 5C-D）。S-III的特点是高水平的Wnt信号通路、蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢过程、DNA修复、MAPK级联、自噬、整合素介导的信号通路、细胞周期、脂肪酸代谢过程、TOR信号传导、Toll-如受体信号传导通路和ERBB2信号传导通路（图5C-D）。三种蛋白质组亚型具有不同的分子背景，代表肿瘤进展的不同阶段。

随后，他们进一步研究了三种亚型之间拷贝数变异的差异，结果显示，chr1q21.1、chr5q35.1、chr7p11.2和chr14q13.3扩增在三个亚型中存在差异（图5A），这些扩增的出现预示着更糟糕的生存（图5E）。位于chr7p11.2的SUMF2、EGFR和GBAS是与拷贝数有显著相关性的前三种蛋白（图5F）。这三个基因的SCNA、RNA和蛋白水平从S-I增加到S-III，EGFR的蛋白水平与临床结果呈负相关（图5H）。

为了验证chr7p11.2扩增的效果，他们研究了与EGFR高表达相关的下游通路改变。Wnt信号传导、泛素介导的蛋白水解和细胞周期由EGFR上调（图5I）。因此，chr7p11.2扩增可能导致EGFR上调，最终促进肺腺癌的肿瘤进展（图5J）。

图5. 肺腺癌的蛋白质组亚型。

(A) 热图显示带有临床特征注释的蛋白质组亚型。(B) 比较不同蛋白质组亚型的无复发生存率的 Kaplan-Meier 图。(C) 三种蛋白质组亚型的富集通路。通过基因集变异分析(GSVA)计算富集分数。(D) 蛋白质组亚型之间差异表达蛋白质的热图。(E) Kaplan-Meier 图比较 7p11.2 扩增与否患者的OS。(F) 位于 7p11.2 的基因的拷贝数变异 (CNV)-蛋白质相关性。(G) 三种蛋白质组亚型中 SUMF2、EGFR 和 GBAS 的 SCNA、RNA 和蛋白质水平。(H) Kaplan-Meier 图比较按 EGFR 蛋白水平分层的患者的 OS。(I)与EGFR蛋白水平相关的富集通路。(J) 7p11.2 扩增通过EGFR上调促进肿瘤进展的工作模型。

他们在186个配对肿瘤样本中鉴定出4种不同的亚型（图6A）。Kaplan-Meier分析显示，与其他三种亚型相比，免疫抑制亚型患者的生存率更差（图6B）。大多数内皮细胞亚型患者有AIS/MIA，而大多数免疫抑制亚型患者有IAC（图6C）。他们进一步分析了按EGFR突变状态分层的四种免疫聚类的患病率，四种亚型间EGFR突变无分布差异（图6A）。内皮细胞亚型在EGFR突变组和WT组中AIS/MIA比例最高，免疫抑制亚型在两组中IAC比例最高。在内皮细胞亚型中，包括内皮细胞和中性粒细胞在内的免疫特征突出，如CD34/VWF/KDR/FLT1/LYVE1和CD16B的高表达（图6D），而B细胞亚型显示出更多的B细胞（图6D）。免疫抑制亚型与其他亚型不同，所有免疫细胞和CD分子的表达都很低（图6D）。

为了研究每个亚型的生物景观和功能过程，他们使用转录组和蛋白质组数据进行了基因集变异分析(GSVA)。内皮细胞亚型中的tnf -κB信号通路富集，B细胞亚型中富集的通路包括同种异体移植排斥反应和干扰素γ应答，DC亚型中富集了IL-2 STAT5信号通路和凝血通路，免疫抑制亚型中富集了DNA修复、缺氧、G2M检查点、E2F靶点、MYC靶点和糖酵解相关通路（图6E-F）。

有趣的是，TP53突变和60岁以上的患者在免疫抑制亚型中表现突出（图6A-F）。GSEA表明TP53突变在RNA和蛋白质水平上对DNA复制和碱基切除修复有积极影响（图6G-H）。

图6. 肺腺癌免疫聚类。

(A) 热图显示蛋白质组图谱，包括 xCell 特征、CD 分子 (RNA)、潜在可靶向的免疫检查点和四个不同免疫聚类中的富集通路（蛋白质组）。(B) 比较四个免疫聚类的OS的 Kaplan-Meier 图。(C) 四个免疫聚类中 AIS/MIA 和 IAC 的比例。(D) 基于基质评分和内皮细胞特征的密度等高线图。(E) 基于四个免疫聚类中的蛋白质组和转录组数据，通过GSVA计算出的 G2M 检查点和 E2F 靶信号转导富集分数的分布。(F)四个基于 RNA 的免疫聚类中TP53突变的比例。(G) 基于按TP53突变状态分层的蛋白质组数据的GSEA。(H) 根据TP53突变分层的 DNA 复制和碱基切除修复基因中 RNA 和蛋白质的分子谱。

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