文献解读|Nat Commun（14.3）：不同孕龄人类新生儿胎粪的宿主来源蛋白质谱

胎粪是一种粘稠、无味、绿黑色的物质，从妊娠第 12 周开始出现在胎儿肠道中。足月新生儿的初次胎粪通常在出生后 48 小时内排出。因此，胎粪可以在出生后无创收集，是研究新生儿胃肠道病理生理状况的理想临床样本，可为新生儿健康提供有价值的见解。然而，不同孕龄的胎粪的综合蛋白质谱仍不清楚。

研究团队对259名新生儿的初始胎粪样本进行了数据独立采集 (DIA) 蛋白质组学分析（图1a）。本研究中使用的首次胎便样本首次胎便从肛门排出的平均时间为11.9±9.47 h。共有259名新生儿（包括163名早产儿）在东京大学医院新生儿重症监护病房或育婴室接受治疗（图1b）。在鉴定出的 5370 种蛋白质中，有些蛋白质仅在有限数量的样本中检测到。因此，他们选择关注在至少 100 个样本中检测到的 3433 种蛋白质，并将它们用于后续分析（图 1c）。值得注意的是，第一次胎粪含有多种人类来源的蛋白质，不仅来自胃肠道，还来自各种组织（图 1d），这些蛋白质具有多种生物学功能（图 1e）。因此，DIA 蛋白质组分析作为一种识别生物标志物的方法具有巨大的潜力，可通过胎粪中的人源蛋白质揭示新生儿疾病的难以捉摸的病因。

图1. 建立活体患者来源的胃肠道类器官生物库。

(a) GC 类器官培养建立和分析的示意图。 (b) 饼图显示已建立的 57 个 GC 类器官的样本来源、肿瘤部位和 TNM 分期。(c) ）2 个生长速度快的 GC 类器官和 2 个生长速度慢的 GC 类器官的代表性图片。(d-e) 热图和火山图分析显示，与低生长率类器官相比，高生长率类器官中最显著的差异表达基因。 (f) 高生长率类器官与低生长率类器官相比的差异基因表达谱的 KOBAS。(g) 高生长率类器官和低生长率类器官之间的干性评分。

男性和女性之间的基因表达和蛋白质合成存在差异，这些差异归因于X染色体失活导致的全基因组DNA甲基化。在新生儿学中，女性新生儿对胃肠道疾病 (GID)[如 坏死性小肠结肠炎 (NEC) 和胎粪相关性肠梗阻 (MRI)]的耐受性比男性新生儿更高，尤其是在早产儿中。因此，他们研究了性别与胎粪蛋白质谱之间的潜在关联，鉴定出 77 种蛋白质在性别之间表现出显著差异。其中，67 种蛋白质在女性中富集程度更高，而只有 10 种蛋白质在男性中富集程度较高（图 2a）。跨膜蛋白酶丝氨酸 11D (TMPRSS11D)、丝氨酸蛋白酶抑制剂 B4 (SERPINB4)、桥粒芯蛋白-3 (DSG3)、短链脱氢酶/还原酶家族 9C 成员 7 (SDR9C7)、胱抑素-A (CSTA)、丝氨酸蛋白酶抑制剂 B3 (SERPINB3)、胱抑素-B (CSTB)、尿苷磷酸化酶 1 (UPP1)、跨膜蛋白酶丝氨酸 11E (TMPRSS11E) 和丝氨酸蛋白酶抑制剂 B13 (SERPINB13) 等蛋白质在女性新生儿中比在男性新生儿中更丰富，而粘附 G 蛋白偶联受体 L1 (ADGRL1) 在男性新生儿中比在女性新生儿的富集程度更高（图S1）。

为了估计这些性别依赖性蛋白质的来源，他们首先使用组织特异性蛋白质列表作为基因集进行了基因集富集分析 (GSEA)。在女性中含量较高的蛋白质在食管、阴道、皮肤和子宫颈等鳞状上皮组织中含量显著增加（图2b）。鉴于在胚胎发育期间，直肠、阴道和尿道分别形成于称为泄殖腔的共同通道，这些蛋白质在女性中大量存在，因此推测它们起源于阴道。在女性中排序前10的通路分别为:内肽酶活性调节、肽酶活性调节、肽酶活性负性调节、水解酶活性负性调节、内肽酶活性负性调节、蛋白水解负性调节、表皮发育、体液免疫反应、蛋白水解调节、细胞-细胞黏附。而在男性中排序前10的通路为：小 GTPase 介导的信号转导、基于微管的过程、细胞成分生物合成的调节、细胞器组装、有丝分裂细胞周期过程、细胞器裂变、有丝分裂细胞周期、核分裂、细胞周期以及有丝分裂核分裂（图2c）。两性胎粪内蛋白质谱的差异可能会影响出生后早期发育过程中胃肠道的应激耐受性。

图2.胎粪蛋白质的差异组成。

(a) 火山图显示男性和女性胎粪蛋白质组的变化。(b)组织特异性蛋白富集分析。(c) GO分析。

图S1. 在包括79名未患病新生儿的独立队列中，女性或男性的蛋白质丰度。

他们探讨了妊娠周龄 (GA) 和胎粪蛋白质谱之间的潜在关联，因为 GA 与胎粪粘度、矿物质成分和糖蛋白组成等特性相关。他们利用简单的线性拟合方法来分析 GA 中蛋白质水平的变化（图S2a）。总共有 1158 种蛋白质显著减少，而 348 种蛋白质随 GA 而增加。他们进一步使用LOESS回归模型来研究与GA相关的波动的、非线性的蛋白质轨迹，正如在血浆和房水中的蛋白质老化模式中观察到的那样（图S2b）。使用无监督层次聚类，根据蛋白质的轨迹模式将其分为六个聚类（图3a-b）。聚类 1 和 2 在妊娠早期呈现增加模式，均富含质膜组织、膜裂变或有丝分裂胞质分裂，提示此阶段与细胞生长、分裂和修复相关的活跃过程（图 3c）。值得注意的是，这些聚类中存在碱性磷酸酶家族，包括肠型碱性磷酸酶、胎盘型碱性磷酸酶和生殖细胞型碱性磷酸酶，该研究强调了胎粪碱性磷酸酶活性与 GA 之间显著的正相关。此外，聚类 4 显示出独特的模式，随 GA 逐渐递减。这些蛋白质特别富集于细胞外基质 (ECM) 和细胞外结构相关蛋白（图 3c）。值得注意的是，层粘连蛋白亚基 γ-1 (LAMC1)、整合素 α-1 (ITGA1)、整合素 α-2 (ITGA2)、整合素 β-1 (ITGB1)、胶原蛋白 VI α-3 链 (COL6A3) 和胶原蛋白 I α-1 链 (COL1A1) 等蛋白质在早产 (PG) 婴儿的胎粪中非常丰富（图S2c-d）。在胚胎阶段，层粘连蛋白和整合素等 ECM 蛋白在胃肠道绒毛和隐窝中均有表达。

图3. 妊娠衰老过程中宿主来源的胎粪蛋白轨迹的聚类。

(a) 无监督层次聚类。(b) 六个已识别聚类的蛋白质轨迹。(c)GO分析。

图S2. 妊娠衰老过程中宿主衍生胎粪蛋白质变化。

(a) 火山图显示胎粪蛋白质随胎龄的变化。(b) 妊娠衰老过程中的蛋白质轨迹。(c) 259个样本在妊娠期衰老过程中具有代表性的细胞外基质蛋白表达变化。(d) 代表性细胞外基质蛋白在妊娠期间的表达变化。

本项研究的目的旨在揭示疾病与胎便蛋白质组之间的潜在关联，以揭示各种疾病（如GID、CHD、CA和CID）的潜在发病机制（图S4a）。他们将不同的胎粪蛋白谱确定为每个疾病类别（图4a-d）。在GID队列中，他们观察到代谢过程（包括分解代谢过程）的富集，而这在其他三种疾病组中并不明显（图 4e）。此外，对肠上皮成熟至关重要的Ras蛋白信号转导通路在GID队列中显著下调。Ras蛋白功能的减弱很可能导致胃肠道组织异常。因此，与GID有关的解剖异常可能会影响胎粪蛋白的功能作用。在 CHD 组中，与膜内定位相关的蛋白质减少，同时细胞器定位蛋白也减少（图 4f）。在 CA 组中，与微管过程和微管细胞骨架组织相关的蛋白质水平降低（图 4g）。在 CID 队列中，排序前十的上调通路与感染反应有关（图 4h）。他们还对妊娠期糖尿病 (GDM) 和妊娠期高血压疾病 (HDP) 病例的胎粪蛋白质组进行了分析，结果表明，患有GDM的母亲所生婴儿的转运功能相关通路富集，而患有HDP的母亲所生婴儿的生物合成和代谢功能相关通路富集（图S4b-c）。总的来说，这些独特的胎粪蛋白谱可能作为特定新生儿疾病发病机制的指标，反映宫内状况。

图S4. 疾病与宿主衍生胎粪蛋白质的相关性。

(a) 维恩图显示新生儿疾病之间的病例重叠，包括GID、CHD、CA和CID。(b) 火山图显示妊娠期糖尿病（左）和妊娠期高血压疾病（右）胎便蛋白质的变化。(c) 基因富集分析。

图4. 产前疾病的胎粪蛋白谱。

(a-d) 火山图显示胎粪蛋白质组随 GID、CHD、CA 和 CID变化的情况。(e-h)GO分析。

为了确定胎粪蛋白的组成是否可以作为 GA 的预测因子，他们应用了LASSO回归模型。首先，以 2:1 的比例随机划分 259 个样本，将样本分为三组：训练组包含149个非疾病样本（不包括特定疾病样本），验证组包含55个非疾病样本，另一个验证组包含55个特定疾病样本。使用 训练组数据（图 5a），基于57种蛋白质开发了GA预测模型。该模型在预测非疾病样本验证组的GA方面表现出很高的准确性（图 5b），但在预测特定疾病样本验证组的GA方面准确性较低（图 5c）。与无疾病样本相比，这些 GID 和 CHD 样本的 GA 差异（预测 GA-实际 GA）明显较低（图 5d），提示GID组可能存在胃肠道发育不成熟，而 CHD 组中的生长迟缓似乎是由于血流和氧合异常造成的。

图5. 通过胎粪蛋白质组学分析预测妊娠周龄的可能性。

(a) 训练队列中的妊娠周龄 (GA) 预测。 (b-c) 验证队列中的 GA 预测。(d) 各队列间实际GA与预测GA差异比较。

本项研究对 259 名不同孕龄新生儿的胎粪进行了广泛的蛋白质组学分析，揭示了 5370 种宿主来源的胎粪蛋白，这些蛋白因性别和孕龄而异。具体而言，早产儿的胎粪表现出与细胞外基质相关的蛋白质浓度升高。此外，胎粪的蛋白质谱也表现出独特的变化，具体取决于特定疾病，包括胃肠道疾病、先天性心脏病和母体状况。此外，本项研究还开发了一种机器学习模型，利用胎粪蛋白预测妊娠周龄。患有胃肠道疾病和先天性心脏病的新生儿可能胃肠道系统尚未发育成熟。这些发现凸显了临床参数与胎粪蛋白组成之间的复杂关系，为评估新生儿胃肠道健康状况的提供了新的理论依据。

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