文献解读|Cell Discov（33.5）：scATAC-seq 和 scRNA-seq 综合分析绘制胸腺 iNKT 细胞发育图谱并确定 Cbfβ 的作用

恒定自然杀伤 T (iNKT) 细胞是先天性 T 细胞，具有 T 细胞和 NK 细胞的特征，可调节广泛的免疫反应和疾病。在小鼠胸腺皮质中，罕见的表达Vα14-Jα18 T细胞受体(TCR)链的CD4+CD8+双阳性(DP)胸腺细胞优先与多种TCR Vβ链（Vβ8链，Vβ7链或Vβ2链）配对，由DP胸腺细胞上的CD1d阳性选择b并高度表达CD24[CD24+，定义为阶段0 (ST0)]。这些新选择的iNKT细胞通过Ccr7的表达进入髓质。这些新选择的iNKT细胞通过Ccr7的表达进入髓质。在胸腺髓质中，它们急剧下调CD24 [CD24−CD44−NK1.1−，定义为阶段1 (ST1)]，然后上调粘附分子CD44并获得记忆或激活表型[CD44hiNK1.1−，定义为阶段2 (ST2)]。ST2 iNKT细胞要么迁移到外周器官，要么保留成为长寿命驻留细胞，并在胸腺中获得NK1.1和其他NK谱系标记物 [CD44hiNK1.1+，定义为阶段3(ST3)]后成熟。

与传统的 αβT 细胞不同，恒定自然杀伤 T (iNKT) 细胞在胸腺中完成向功能性iNKT1/2/17 细胞的终末分化。然而，指导NKT 亚群分化的潜在分子程序仍不清楚。

为了揭示iNKT 细胞的发育状况，研究者团队通过荧光激活细胞分选 (FACS) 收获连续发育阶段的胸腺iNKT 细胞，用于单细胞转录组分析(scRNA-seq) 和单细胞ATAC测序(scATAC-seq)（图1a-b）。他们使用rec-Vα14Tg小鼠对ST0 iNKT细胞以及使用C57BL/6小鼠对ST1 (CD24−CD44loNK1.1−)、ST2 (CD24−CD44hiNK1.1−)和ST3 (CD24−CD44hiNK1.1+) iNKT细胞进行scRNA-seq分析（图1a-c）。

在聚集的iNKT 细胞 (ST0-ST3) 中总共鉴定了 16 个聚类(C1–C16)，每个聚类包含了 255-2817 个细胞（图1d-e），每个聚类中差异最大的表达基因(DEG) 显示在热图（图1f）和小提琴图（图1g）中。这些聚类中，四个聚类（C2、C4、C9 和 C14）来自 ST0，八个聚类来自 ST1（C3、C5、C6、C7、C10、C11、C15 和 C16），九个聚类来自 ST2（C1、C3、C5、C6、C7、C10、C11、C13 和 C15）和四个聚类来自 ST3（C1、C5、C8 和 C12）（图1d）。ST0 iNKT 细胞与其余iNKT 阶段明显分开，来自 ST1 和 ST2 iNKT 细胞的聚类适度重叠，而来自 ST3 的iNKT 聚类与来自 ST2 iNKT 细胞的聚类紧密相邻（图1d）。

图1. 小鼠胸腺iNKT细胞的多样性。

(a) 收集iNKT细胞用于scATAC-seq和scRNA-seq分析。 (b) 分选策略。(c)实验设计概述。(d) scRNA-seq数据集的t-SNE图。(e) 在ST0-ST3中聚集的iNKT细胞中定义的16个聚类的分数。(f)排名前10的DEG热图。(g) 小提琴图分析聚类相关基因。

细胞分化伴随着受顺式调控元件控制的基因的表达，这些元件必须处于开放状态才能正常发挥作用。因此，他们对来自不同发育阶段的胸腺iNKT 细胞（如 scRNA-seq 分析中的细胞）进行了 scATAC-seq 分析，并使用 RSeurat 和 Signac 软件绘制了单个iNKT 细胞的染色质可及性图谱（图2a）。他们发现来自 ST1 和 ST2 的 C3、C6、C7、C10、C11、C15 和 C16 聚类分类为iNKT2 子集；主要来自 ST3 的 C1、C5、C8 和 C12 聚类分类为iNKT1（图2b），而 ST2 中唯一的iNKT C13 分类为iNKT17（图2b）。

总体而言，通过整合转录组和表观遗传图谱，他们绘制了具有 16 个聚类的胸腺iNKT 细胞的动态转录组和染色质图谱，并揭示了iNKT1 和iNKT2 细胞的异质性以及iNKT17 细胞的相对同质性。

图2. 不同的聚类分配到功能子集中。

(a) UMAP图显示了对分选的 ST0–3 iNKT 细胞的 scRNA-seq 和 scATAC-seq 的综合分析。(b) 气泡图显示聚集的iNKT 细胞的各个聚类(C1–C16) 中的基因表达。

胸腺中的iNKT 细胞发育依赖于位于胸腺皮质的约 1000 个 ST0 iNKT 前体 (iNKTp) 库。他们在 ST0 中鉴定了四个聚类（C2、C4、C9 和 C14）（图 1d和图3a），并突出显示了每个聚类的特定特征（图3b）。

根据CD4和CD8的表达，这些ST0聚类可分为三组：C14是CD4+CD8+ (DP) iNKTp；C9是CD4+CD8−(CD4SP) iNKTp，富含T淋巴细胞存活调节因子，包括Id2和Il7r；C2和C4是CD4−CD8−(DN) iNKTp，其中C4高表达Cd5和Cd6，而C2 iNKTp则高表达Egr2和Slamf6，它们分别通过调节PLZF表达和TCR信号强度影响iNKT细胞发育（图3b-d）。还在ST0中发现了一个小的DP iNKTpj聚类 (C14)（图3c-e）。

为了探索选择后的发育程序，他们进行了伪时间轨迹分析，鉴定了两个潜在的发育分支：C14-C2-C4分支（称为DP-DN）和C14-C9分支(DP-CD4SP)（图3f）。两个分支最终在发育末端相遇，趋化因子受体Ccr7的表达增加（图3g），这是ST0 iNKTp从胸腺皮质迁移到髓质所必需的。DP iNKTp下调CD4和CD8的表达，启动胸腺皮质的DP- cd4sp或DP- dn发育过程，最终迁移到胸腺髓质。

接下来，他们评估了ST0 iNKTp中Zbtb16 （编码 PLZF）的表达模式和染色质可及性，发现Zbtb16的+40kb和TSS在DP iNKTp (C14)中不可及，但在CD4SP (C9)和DN (C2和C4) iNKTp中可及，C2比C4开放程度高得多，与Zbtb16的表达模式非常相似（图3i-j）。伪时间轨迹和流式细胞术进一步表明Zbtb16在DN和CD4SP iNKTp中均富集（图3j-k）。

RORγt 是调节iNKT17 分化的关键转录因子，但也在 DP 胸腺细胞中高表达并促进iNKT 细胞选择。与Zbtb16不同的是，+ 4kb区域的Rorc（编码RORγt）在DP (C14)和DN (C2和C4) iNKTp中均可及，但在CD4SP (C9)中不可及，而+ 13kb区域的Rorc仅在DP iNKTp (C14)中可及。在每个聚类中，Rorc的表达模式与其染色质可及性状态一致（图3l）。Rorc在DP iNKTp中显著高表达，在DN分支（C4和C2）中逐渐下调，而在CD4SP (C4)中几乎没有检测到（图3m-n）。

图3. ST0时iNKT细胞的细胞多样性。

(a)来自排序的 ST0 iNKT前体 (iNKTp)的 scRNA-seq 数据集的 t-SNE图。(b) 描述 ST0 iNKTp中每个聚类中特定基因表达的特征图。(c) 描绘Cd4、Cd8a的单细胞基因表达及其共表达的特征图（上）。条形图代表聚类中Cd4和Cd8a的平均 (Ave) 表达（底部）。(d) CD4 与 CD8 表达的代表性流程图。(e) 来自C57BL/6 小鼠（红色）和rec-Vα14Tg 小鼠（绿色）的每个聚类衍生的ST0 iNKT 细胞中Cd8表达的小提琴图。 (f) ST0 iNKTp 在 Monocle 3 定义的状态空间中沿着伪时间的排序。(g) 特征图描绘了ST0 iNKTp 发育中Ccr7的单细胞基因表达轨迹（左）。条形图代表Ccr7的 Ave 表达（右）。(h) ST0 iNKTp中 Ccr7 表达的代表性流程图（左）。条形图显示平均 CCR7+ iNKT ± SD（右）。(i) 在ST0 iNKTp聚类中聚合Zbtb16 和Rorc的scATAC-seq轨迹。(j-m) ST0 iNKTp发育过程中Zbtb16和Rorc单细胞基因表达的特征图。(k-n) ST0 iNKTp中PLZF和RORγt表达模式的代表性流程图。

为了了解ST0 后iNKT 聚类的发育，他们将胸腺iNKT 细胞（ST0-ST3）映射到伪时间轨迹上（图4a）。iNKT2细胞显示出广泛的多样性，包括C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16聚类（图2b和图4a-b）。他们评估了整合的iNKT 细胞聚类 (C1–C16)中的Zbtb16染色质可及性。在Zbtb16基因座的 181 kb 中，从iNKT2、iNKT1 和iNKT17 中发现了高度可及的区域，但在 ST0 聚类（C2、C4、C9 和 C14）中发现了可及性较弱的区域。Zbtb16表达与其染色质可及性密切匹配（图4c）。iNKT2 聚类以及 ST0 中的 C2 和 C9 显示出GATA3的高活性基序结合活性，这对于iNKT2 分化至关重要（图4d）。正如预期的那样，iNKT2 细胞的大多数特征基因逐渐增加，直至在中间阶段达到峰值，然后在终末分化期间下调。然而，一些基因，包括Btg1、Cebpb和Osgin1，仅出现在iNKT 发育末端附近，这可能与iNKT2 细胞终末事件有关（图4e）。细胞周期通路富集分析表明iNKT2聚类（C7、C11和C15）表现出高度增殖特征，处于S期（C7）或G2/M期（C11和C15）（图4f）。

创新路径分析(IPA) 表明 C3、C6、C10 和 C16 在功能上不同。C16 是iNKT 细胞从 ST0 到 ST1的过渡阶段，这些细胞与糖酵解和氧化磷酸化相关的基因表达急剧升高（图4g），表明它们的能量需求增加。C6终止于ST1，这些细胞富含TCR信号、共刺激信号、细胞骨架、TNFR以及细胞死亡和耗竭通路中的基因（图4g）。

图4. iNKT2细胞的细胞多样性。

(a) 在 Monocle 3 定义的状态空间中，iNKT 细胞沿伪时间排序。 (b) 特征图描绘了Zbtb16在iNKT细胞发育中的单细胞基因表达轨迹。(c) 聚合 scATAC-seq 浏览器跟踪iNKT细胞聚类的Zbtb16（左）。条形图代表iNKT 细胞聚类中的Zbtb16平均 (Ave) 表达（右）。(d) 由GATA-3结合基序的活性着色的UMAP投影。 (e) 热图显示了从 scRNA-seq 数据的iNKT2 聚类C3、C6、C10 和 C16中选择的大多数 DEG 的伪时间排序。(f) 特征图描绘了聚集iNKT细胞发育过程中G1、G2/M和S期的单细胞基因表达轨迹（左）。柱状图表示G1、G2/M和S细胞在iNKT细胞聚类中的比例（右）。 (g) 聚类 C3、C6、C10 和 C16 中的 DEG。

iNKT1细胞分化由转录因子Tbx21控制并分配至四个聚类（C1、C5、C8和C12）（图2b和图5a）。在Tbx21位点的 17.2 kb 内，启动子区域 –3 kb 和 –4 kb 在 C1、C5 和 C12 中可及，但在 C8 中不可及（图 5b）。重要的是，tbx21结合基序活性也出现在这些聚类中，但不在ST0聚类中（图5c）。流式细胞仪分析进一步证实了一小部分 PLZF hi iNKT2细胞在ST1和ST2中表达T-bet（由Tbx21编码），通过Ki-67检测其具有相当大的增殖能力（图5d）。因此，iNKT1 祖细胞可能隐藏在这些所谓的增殖性 PLZF hi T-bet hi iNKT2 细胞中。

他们发现一个新的特征，即信号淋巴细胞激活分子家族成员7(Slamf7)在iNKT1细胞聚类中富集（图5e）。基于PLZFloT-bethi iNKT1细胞中SLAM7与NK1.1表达的强相关性，流式细胞分析进一步证实了这一点（图5f）。NK细胞相关特征Slamf4进一步将末端C12与其他iNKT1细胞聚类区分开来。SLAMF4+ iNKT细胞(C12)以DN为主，并逐渐从PLZFloT-bethi iNKT1细胞中发育（图5g-i）。SLAMF4 + iNKT1 细胞主要分泌 IFN-γ 和较少的 IL-4，如“经典iNKT1 细胞”，而大多数 SLAMF4- iNKT1 细胞在刺激后既分泌 IL-4 又分泌 IFN-γ（图5j）。C5细胞富含Ifit1和Ifit3，它们参与干扰素信号通路（图5k）。总体而言，iNKT1细胞从目前定义的“ iNKT2细胞”的ST1开始发育，并逐渐完成分化并转变为SLAMF4+ i NKT1 细胞位于末端，与经典的 IFN-γ 分泌iNKT1 细胞一样。

图5. iNKT1细胞具有广泛的细胞异质性。

(a) 特征图描绘了iNKT 细胞发育中Tbx21的单细胞基因表达轨迹。 (b) 对于iNKT细胞聚类，Tbx21的scATAC-seq聚合（左）。条形图表示iNKT细胞聚类中Tbx21平均值(Ave)的表达（右）。 (c) 对于iNKT细胞聚类，Tbx21的scATAC-seq聚合（左）。条形图表示iNKT细胞聚类中Tbx21平均值(Ave)的表达（右）。(d) iNKT的门控代表性流程图。(e) iNKT细胞发育过程中Slamf7单细胞基因表达轨迹。(f) iNKT细胞中SLAMF7与NK1.1表达的代表性流图。(g) 条形图表示Slamf4 Ave在iNKT细胞聚类中的表达。(h) SLAMF4在iNKT2 (PLZFhiT-bet−)和不同iNKT1 (T-bethi)细胞中的代表性表达流图。(i) 点图表示平均SLAMF4±SD。(j) SLAMF4−（左）和 SLAMF4+（右）iNKT1 细胞在 PMA/Ionomycin刺激 4 小时后IL-4 与 IFN-γ 产生的代表性流程图。(k) 聚类C1, C5, C8和C12中的DEG。

他们将C13分类为iNKT17细胞，并与其他聚类明显分离（图2b和图6a）。他们观察到Rorc的+4 kb和+14 kb区域在ST0聚类（C2、C4和C14）和成熟的iNKT17聚类(C13)中可及（图6b），并且RORC的结合基序在iNKT17和ST0 iNKTp中发生激活（图6c）。在 mRNA 水平上，RorcST0 中的 C14 中高表达，这与Rorc处的染色质可及性一致，但在 C4 和 C2 中逐渐下调，并在 C13 中重新上调，表明其他转录因子可能靶向开放Rocr位点并操纵iNKT17 分化过程中Rorc 的表达。

为了追踪iNKT17细胞的发育轨迹，他们进一步检测了有序iNKT细胞轨迹中的iNKT17特征基因，发现包括Rorc在内的少数iNKT17特征最初在早期iNKTp中表达，然后才转化成成熟的iNKT17。然而，大多数iNKT17 相关特征在iNKTp中几乎没有表达（图6d）。他们进一步发现，一种新的标志性水通道蛋白3 (Aqp3) 在胸腺i NKT17 (PLZF int RORγt +) 细胞中特异性表达（图 6e-f）。总体而言，iNKT 细胞可能在 ST0启动iNKT17 定型，并且这些iNKT17 细胞表现出有限的异质性。

图6. iNKT17细胞表现出有限的异质性。

(a) iNKT 细胞发育中Rorc的单细胞基因表达轨迹的特征图。(b) iNKT细胞聚类的scATAC-seq（左）。柱状图表示iNKT细胞聚类中Rorc平均值(Ave)的表达（右）。(c) 由RORC-结合基序的活性着色的UMAP投影。(d) 显示scRNA-seq数据聚类13中前30个基因的伪时间排序的热图。(e) 表征iNKT细胞发育过程中Aqp3单细胞基因表达轨迹的特征图。(f) Aqp3表达的代表性流程图。

Egr2和Slamf6通过调节ST0 中的Zbtb16表达和 TCR 来控制早期iNKT 细胞发育。他们鉴定了一种新的共转录因子Cbfβ ，它与Egr2和Slamf6表现出相似的表达模式，并且在iNKT 细胞的 ST0 表现出较高程度的富集，特别是在 DP-DN 分支 C2 中（图7a-b）。

Cbfβ的缺失导致胸腺iNKT细胞的频率和绝对数量严重减少（图7c）。Cbfβ 敲除(KO)小鼠中ST0和ST1 iNKT细胞的频率显著增加，但Cbfβ KO和WT对照之间的绝对数量相当（图7d）。有趣的是，DP iNKTp 在 ST0 中增加Cbfβ KO小鼠中的iNKT细胞（图7e），表明Cbfβ的敲除部分阻断了DP iNKTp向CD4 SP或DN谱系的转化。

ST1 iNKT 细胞经历快速增殖，并包含具有高Zbtb16编码 PLZF 表达的iNKT 子集的祖细胞。他们观察到在Cbfβ KO iNKT细胞中ST1处的PLZF表达显著下调（图7f）。在增殖标记物Ki-67上也观察到类似的现象（图7g）。这些数据表明，Cbfβ缺陷的iNKT 细胞进入相对静止状态，并且无法在 ST1 正常上调 PLZF 表达。

此外，ST1 中其余的 PLZF+ iNKT 细胞无法共表达 T-bet 来启动iNKT1 分化，也无法共表达 RORγt 以启动NKT17分化（图7h-i）。这些结果表明Cbfβ是控制早期iNKT细胞在ST0发育，ST1/2 iNKT细胞分化和ST3最终成熟的关键调节因子（图7j）。

图7. Cbfβ调控iNKT细胞早期定型。

(a) 特征图描绘了ST0 i NKT 细胞发育过程中Cbfβ、Egr2和Slamf6的单细胞基因表达轨迹。 (b) iNKT 细胞不同阶段的Cbfβ表达以及ST0 i NKT 细胞不同聚类（C2、C9、C4 和 C14）中Cbfβ表达的小提琴图。(c) 来自Cbfβ KO 和 WT 小鼠的iNKT 细胞的代表性流动图（左）。(d) Cbfβ KO 和 WT 小鼠i NKT（富集抗 CD1d 四聚体后）不同阶段的代表性流程图（左）。条形图代表Cbfβ KO 和 WT 对照中iNKT 细胞频率和iNKT 细胞数量的平均值±SD（右）。 (e) 来自Cbfβ KO 和 WT 对照的 ST0 iNKT 细胞中 CD8 和 CD4 表达的代表性流程图（左）。条形图代表 DP、DN 和 CD4 SP ± SD 的平均值 ± SD（右）。 (f-g) 直方图显示Cbfβ KO和WT小鼠ST1 iNKT细胞中PLZF表达和Ki-67表达。 (h) Cbfβ KO和WT小鼠ST1 iNKT细胞PLZF与T-bet表达的代表性流动图。 (i) Cbfβ KO和WT小鼠ST2 iNKT细胞PLZF与RORγt表达的代表性流动图。(j) 小鼠iNKT细胞发育轨迹示意图模型（左）和Cbfβ在iNKT细胞发育中的作用（右）。

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