文献解读|Proteomics（5.393）：COVID - 19患者血清乳酸脱氢酶升高的蛋白质组学和代谢组学研究

144名COVID-19患者的临床数据和实验室特征见表1。患者平均年龄47岁，男性占53.5%。重症患者占25%（36/144），重症患者平均年龄比非重症患者大10岁，且入院时更可能出现发热症状。重症患者接受吸氧、抗生素、糖皮质激素和静脉注射γ免疫球蛋白治疗的比例高于非重症患者。

根据实验室检查结果，重度患者血清LDH水平高于正常值上限的百分比显著高于非重度患者（58.3% vs 7.4%）。同样，病情越严重的患者，血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素、肌酐和肌酸激酶（CK）的水平也越高。以7天为一次间隔，比较了它们的时间变化（表2）。重症患者血清LDH、CK、肌酐持续下降，非重症患者仅血清LDH持续下降。采用Cox回归模型评价这些指标的预后价值，结果表明，LDH是多变量分析中唯一具有区分能力的指标，表明血清LDH可能是有用的预后生物标志物。

表1 COVID-19患者的临床数据和实验室指标

表2 重症和非重症COVID - 19患者临床实验室检查结果的动态变化

作者评估了年龄和性别对血清LDH表达的影响。大于60岁的COVID-19患者显示出较高的血清LDH表达 (图1A)，这可能是由于老龄和潜在的疾病导致。在最初住院阶段 (一周内)，男性患者血清LDH水平高于女性 (图1 B)。3周后，COVID-19患者和健康对照组的血清LDH水平相当（平均值：60岁以上177 U/L，60岁以下152 U/L；男性154 U/L，女性158.5 U/L）。

作者比较了住院初期（住院后1-3天）和出院前1-3天的重症和非重症患者血清LDH水平，结果发现重症患者血清LDH水平显著升高，尤其是住院初期（图1 C）。此外，在住院的32例患者中（重症22例，非重度11例），重症患者血清中LDH-2、LDH-4和LDH-5水平显著高于非重症患者，而LDH-1和LDH-3差异不显著（图1D）。LDH-4和LDH-5主要有助于低氧条件下的丙酮酸发酵，而LDH-1有利于可逆反应的反向进行。这表明重症患者存在无氧糖酵解代谢。

为了更好的理解血清LDH水平随时间的动态变化，作者以3天为一次间隔，检测了从住院第1天到第21天的血清LDH       水平（图1E）。对于非重症患者组而言，在入院时血清LDH水平略高，但在住院期间缓慢下降。随着治疗时间延长，重症患者血清LDH水平从第3天到第9天显著下降，到第21天时降至非重症患者的初始水平。

图1 血清LDH表达水平

将患者的严重程度（重症vs非重症）作为二分变量，对血清LDH水平进行ROC分析。曲线下面积 ( AUC ) 为0.864 (图1F )，证实了血清LDH的诊断效能。最大约登指数对应的血清LDH水平为247 U/L，而已有的研究报道血清LDH异常的阈值为 240~253.2 U/L。基于以上数据，将14名患者分为2组，低风险组（LR）包含7例患者，自住院以来血清LDH含量低于247 U/L；高风险（HR）组也包含7例患者，其中6例为入院时血清LDH水平高于247 U/L的重症患者，1例为住院期间血清LDH水平低于阈值的重症患者。

由于所有患者的血清LDH水平均以相对较高的水平开始并随时间下降，我们将其归因于首次采样时间点相对较晚（第8天）。患者HR 3和患者HR 7在住院时具有异常高的血清LDH水平（大于450 U/L），但在10天内急剧下降（图1G）。我们检查了14例患者的详细病历（表3）。合并高血压、慢性HBV感染和糖尿病的COVID-19患者在HR组中倾向于发展为重症患者。

表3 时间变化相关的重症患者病历资料

在LR组和HR组间一共鉴定到34个差异表达蛋白（DEPs）。与LR组相比，HR组中26个蛋白显著上调，8个蛋白显著下调（图2A）。这些DEPs显著富集到免疫相关通路，如急性炎症应答，血小板脱粒和补体级联调节（图2A）。数据显示HR组中急性期蛋白（SAA1、ORM1、AGT和SERPINA3）、补体亚基（C9、C6和CFI）和LDH亚型（LDHA和LDHB）表达上调（图2B）。将差异蛋白绘制成互作网络，促炎细胞因子IL-6位于网络中心，其被认为是COVID-19的风险因素，临床数据表明IL-6与血清LDH水平呈正相关（图2C）。此外，IL-6可激活TP53，促进细胞凋亡，并提高血液中LDHA的含量。

图2 低、高风险患者之间的分子差异

图3列出的34种差异表达代谢物中，和LR相比，HR组中有30种上调，52.9%的代谢物为脂质。其中，7-羟基胆固醇（β）介导氧化应激并诱导细胞凋亡（图3A和图3B），研究表明其在乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染期间升高。蛋白质-代谢物联合网络（图3B）提出了两种上游分子来调节LDHA表达，包括介导缺氧和炎症微环境的缺氧诱导因子1（HIF1）和涉及COVID-19肺纤维化的纤维连接蛋白1（FN1）。

图3 低、高风险患者血清差异表达代谢物分析

作者分析了入院时血清LDH水平异常高的2例患者（HR3和HR7，定义为异常HR组），并将其与其他正常HR患者进行差异蛋白分析（图4A）。结果发现，包括LDHA和LDHB在内的38种蛋白质差异表达（图4A）。对于异常HR组中的特征蛋白，数据显示包括5个上调的蛋白酶体亚基蛋白，即PSMA 3、PSMA 4、PSMA 5、PSMB 1和PSMB 3在异常HR组升高（图4B），这可能是由于器官/组织损伤导致的细胞凋亡。对于异常HR组中的其他上调蛋白（图4B），CES1是一种肝脏蛋白，其在血液中的释放提示肝损伤；P4HB在缺氧时升高；GAPDH可通过在缺氧中激活NF-κB诱导增强HIF活性，这有助于热休克蛋白90-α（HSP90AA1）上调，与Hif 1 α形成蛋白复合物；DPP 4为感染易感性的潜在标志物，抑制DPP 4可降低COVID-19患者的严重程度。CPB2在异常HR组中下调，它是一种碱性羧肽酶，可抑制补体系统介导的炎症。此外，在异常HR组中，6个免疫球蛋白残基（IGHV343、IGHV3 - 30 - 5、IGKV1 - 5、IGLV1 - 36、IGKV1 - 17和IGKV2 - 24）表达上调（图5A）。代谢组分析表明，异常HR组中84.6%的失调代谢物为脂质（图5B），表明脂质代谢紊乱伴随着血清LDH变化。网络分析（图5C）进一步表明LDH升高与HSP90AA1和蛋白酶体相关。

图4 异常HR和正常HR组之间的蛋白差异

图5 异常HR和正常HR组之间的代谢物差异

作者最后总结了COVID-19患者血清LDH升高的调节模式（图3C）。一方面，由宿主免疫系统引发的炎症过程诱导受感染细胞的凋亡，导致细胞内LDH释放到血液中。在HR病例中，这些免疫活性导致过度的炎症反应（如“细胞因子风暴”），诱发多个器官/组织损伤，从而释放LDH；另一方面，研究表明严重COVID-19患者会发生缺氧反应，通过糖酵解积累乳酸。LDH可通过丙酮酸发酵和一系列代谢调节来平衡乳酸分泌，以维持细胞内稳态。此外，在缺氧条件下激活的NFκB和HIF通路也可诱导炎症反应。

 + + + + +