文献解读|（33.883）：肾上腺素B2受体酪氨酸激酶是原癌基因MYC和巴雷特肿瘤核心分子程序的调节剂

首先，作者使用InFlo系统生物学框架，根据来自预处理EAC/BE和非恶性（正常SQ和胃）活检组织中得到的RNA-seq数据，确定了BE-EAC发展中最常发生变化的通路网络。发现EphB2酪氨酸激酶信号在100%的BE和88%的EAC中过度激活(图1A)，与正常SQ和胃组织相比，BE/EAC病变中选择性地诱导EphB2受体，同时EphB配体(EFNB1和EFNB2)略有增加(图1B)。

为了测试EphB2在BE和EAC中诱导的共性，他们对单纯非恶性、癌前病变和EAC活检组织(n=885)进行RNA-seq分析发现，与正常食道SQ和胃组织相比，BE化生/异型增生/腺癌组织中EphB2的诱导显著(>8倍)并有差异(P<0.0005) (图1C)。IHC分析亦证实在BE和EAC病变中选择性地诱导了EphB2蛋白的表达(图1D)。免疫印迹分析显示，BE-EAC细胞中EphB2蛋白的表达高于正常食道SQ细胞系，而且EFNB1/B2配体在SQ、BE和EAC中都有表达，尤其在EAC细胞中表达水平较高(图1E)。

图1. BE和EACs中EphB2信号的过度激活

接下来，为了了解EphB2信号下游的介质和效应通路，作者对EphB2进行基因敲除并对具有代表性的EAC和BE细胞系进行了RNA-seq和InFlo分析。发现除了先前在BE/EAC中涉及的通路， c-MYC活性和相关的转录网络受EphB2正向和显著调节(图2A)。有趣的是，EphB2不调节MYC RNA的表达(图2B)。在EphB2基因敲除后，通过对EAC(SKGT4，OE33)和BE模型(CP-A，CP-D)进行qPCR和WB分析进一步评估，发现SKGT4和CP-D在EphB2基因敲除后MYC RNA表达无变化，而OE33和CP-A则相对下降(图2C)。然而，WB分析显示，在所有BE和EAC细胞系中，EphB2基因敲除后MYC蛋白明显受到抑制(图2C)，而EphB2的诱导与原发BE/EAC病变中MYC蛋白的阳性相关(图2D)。值得注意的是，先前的研究结果进一步表明，EphB2对MYC蛋白本身具有直接调节作用，是调节的主要模式之一。具有代表性的EAC(SKGT4)细胞系中EphB2的敲除加速了MYC的降解(图2E)，进一步支持了EphB2对MYC的翻译后调控。

图2. MYC是EphB2信号的下游靶点

为了进一步探讨EphB2对MYC蛋白调控的机制，作者在一个具有代表性的EAC系(SKGT4)中，用原始EphB2抗体或对照IgG抗体以及EphB2稳定重组和不稳定重组进行了IP。通过质谱分析确定MYC结合蛋白2(MYCBP2)是内源性EphB2结合蛋白的结合伙伴(图3A)，并用正反向IP-WB分析验证了这一点(图3B)。

MYCBP2是一种非典型的E3泛素蛋白连接酶，它介导靶蛋白上苏氨酸/丝氨酸残基的泛素化。值得注意的是，MYCBP2与MYC的反式激活结构域相互作用，被推测为促进或以其他方式调节MYC的活性。EAC细胞中的CO-IP研究确实证实了内源性MYCBP2-MYC相互作用(图3C)。此外，与对EphB2的发现相反(图2B和C)，MYCBP基因的敲除与EAC、BE化生和异型增生细胞系中MYC蛋白的增加有关(图3D)，表明它在Barrett瘤中起到MYC负调控的作用。相反，MYC的敲除并不影响EphB2或MYCBP2，表明EphB2和MYCBP2在调节级联中都位于MYC的上游(图3E)。

为了进一步了解EphB2、MYCBP2和MYC之间的功能关系，他们在EAC/BE细胞中进行了EphB2和MYCBP2的敲除。值得注意的是，MYCBP2基因敲除与EphB2沉默同时发生，并不能完全恢复仅在MYCBP2基因敲除中观察到的MYC水平(图3F)。鉴于MYCBP2是一种E3泛素连接酶，沉默EphB2或MYCBP分别导致MYC泛素化增加或几乎全部抑制(图3G)。与单独敲除MYCBP2相比，与EphB2沉默同时丢失MYCBP2并不能完全抑制MYC泛素化(图3G)。总之，这些发现强烈表明，EphB2在翻译后调节MYC的稳定性/活性，部分是通过它与MYCBP2和泛素-蛋白酶体途径的相互作用。

图3. EphB2与MYCBP2相互作用

接下来，作者通过在不同的EAC细胞模型中进行EphB2基因敲除来评估EphB2信号的表型后果，发现EphB2基因敲除显著阻碍了多种EAC细胞的增殖能力(图4A)。为了进一步证实该结果，他们用稳定表达Dox诱导的EphB2 shRNA的EAC细胞(SKGT4)重复了该分析，并再次发现EphB2基因的敲除显著减少了EAC的菌落生长(图4B)。此外，EphB2基因敲除显著降低了MYC蛋白水平并阻碍了体内EAC肿瘤移植瘤的生长(图4B)。

为了明确EphB2相关的生长依赖是否特定于恶性阶段，或者它们在先前的BE病变中是否明显，作者在BE化生(CP-A)和BE异型增生(CP-D)细胞中进行了EphB2 siRNA敲除。发现结果与先前观察类似，EphB2的敲除显著降低了BE-化生和-异型增生细胞的存活率(尽管程度较小)(图4C)。

图4. EphB2影响EAC和BE细胞的生长特性

hTERT永生化食管SQ细胞（EPC2）在作为食管3D器官型培养（OTC）生长时形成分层鳞状细胞层，模拟体内食管形态和稳态。永生化的EPC2细胞用EphB2或填充物对照载体稳定重组，尽管对照EPC2细胞如预期的那样分化并成熟为持久的复层SQ上皮，即使对细胞增殖没有影响，但EphB2的重组扰乱了SQ-OTCs的形态和正常成熟(图5A)。对BE相关柱状分化标记的评估显示，在EphB2重组的EPC2 OTC和单层培养中SOX9和FOXA2的表达增加(图5A和B)，而FOXA2在EPC2-SQ和BE细胞中均受到EphB2的一致调节(图5B)。EphB2的激活也导致了p63的适度下降(图5B)，这是一种对鳞状上皮的发育和动态平衡至关重要的转录因子。重要的是，EPC2-SQ细胞中EphB2的重组增强了OTC和单层培养中的MYC蛋白(图5A和B)，同样对MYC RNA水平没有显著影响(图5C)。与此一致，EphB2也适度影响MYC的降解(图5C)，并显示出与SQ细胞中MYCBP2的相互作用（图5D）。

图5. EphB2的激活破坏了食道SQ上皮的成熟

鉴于上述观察，接下来作者评估了EphB2和MYC在食道粘膜下腺(ESMGs)中的作用，ESMGs是一组参与食管损伤修复的前体细胞。因此，他们首先评估了ESMGs中EphB2的状态（这些ESMGs是从EAC患者接受化疗前手术切除的食管组织中获得的），在与EAC相关的ESMG中观察到了EphB2和MYC选择性的稳健模式（图6A）。接下来他们将自手术切除的单纯非EAC食道组织作为额外的对照，结果显示EphB2和MYC缺失。除此之外，他们使用源自猪食管的ESMGs的配套球体培养模型，进行单细胞RNA-seq和Inflo分析来评估EphB2-MYC的活性，发现BE样球体的EphB2和MYC活性显著高于SQ样ESMG球体，与细胞周期时相无关(图6B)。这些发现进一步表明，在前体细胞中诱导EphB2-MYC活性可能是BE发育的关键步骤。

图6. EphB2-MYC在ESMG相关ADM和猪类ESMG球体中的激活

上述研究结果表明EphB2-MYC轴是EACS潜在的脆弱治疗靶点，然而，尚无临床批准的针对EphB2或c-MYC的抑制剂。有效的临床批准的MEK1抑制剂(Meki) 考比替尼在EAC细胞系中显示出显著的细胞毒性，因此作者在多种肿瘤异种移植模型中评估了考比替尼的抗肿瘤效果，发现其可导致体内EAC肿瘤生长的强烈抑制和/或消退，而且肿瘤中MYC蛋白显著减少(图7)。这些发现表明，对Meki的反应阈值可能取决于ERK、MYC和/或其他下游效应器的相对/联合水平，靶向MYC相关的上游信号轴可能是一种有益的EAC新治疗策略。

图7. 抑制MEK可抑制MYC活性和体内EAC肿瘤生长

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