English文献解读|Antioxidants（7.675）：褪黑素减轻H2O2诱导的猪滋养外胚层细胞氧化应激
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论文ID
原名：Melatonin Alleviates Oxidative Stress Induced by H2O2 in Porcine Trophectoderm Cells
译名：褪黑素减轻H2O2诱导的猪滋养外胚层细胞氧化应激
期刊：Antioxidants
影响因子：7.675
发表时间：2022.5.25
DOI号：doi.org/10.3390/antiox11061047
背 景
妊娠是动物繁殖必经的过程，随着胎盘发育成熟和血管生成，胎盘从一个低氧环境转换为富氧环境，同时胎盘线粒体数量多，代谢率高，ROS的生成增加，因此，胎盘很容易遭受一定程度的氧化应激，这极大地影响了动物的繁殖功能和胎儿发育。猪滋养外胚层细胞（PTr2）是胎盘中一类重要的细胞，研究表明，PTr2细胞的氧化应激可导致早期妊娠失败和胎盘形成受损。因此，提高PTr2细胞的抗氧化能力有利于维持猪胚胎的生长发育，提高母畜的生产性能。本研究使用转录组测序技术，分析了褪黑素（MT）对过氧化氢（H2O2）诱导的PTr2细胞转录组的影响，研究结果可为开展MT在妊娠期的临床应用提供理论依据，并为制定有效的营养策略以改善母猪健康提供指导。
实验设计
结 果
01
H2O2对不同MT浓度处理下PTr2细胞活力的影响
使用120 µM H2O2处理细胞4小时，以此建立氧化应激模型。和对照组相比，H2O2处理后细胞活力降低到50.1%（图1A）。使用不同浓度的MT (50、100、200和500 µM) 预处理PTr2细胞24 小时，然后再使用120 µM H2O2 处理4小时。结果表明，使用500 µM的MT预处理，可以显著增强H2O2 处理的PTr2细胞的活力（图1B）。
图1 MT对PTr2细胞抗氧化特性的影响
02
MT对H2O2诱导PTr2细胞凋亡的保护作用
为了进一步研究MT是否能保护由H2O2诱导的PTr2细胞凋亡，使用流式细胞术评估凋亡率。结果表明，H2O2处理下，细胞凋亡率显著高于对照组，而MT预处理后，H2O2诱导的PTr 2细胞凋亡率显著降低（图2）。
图2 MT对H2O2诱导PTr2细胞凋亡的影响
03
MT对H2O2诱导PTr2细胞ROS产生的影响
为了探究MT的抗氧化活性，作者检测了PTr2细胞内ROS的含量。结果表明，H2O2处理可以显著升高细胞内ROS含量，但500 µM的MT预处理可以显著减少ROS产生（图3）。
图3 MT对H2O2诱导PTr2细胞ROS释放的影响
04
PTr2细胞转录组测序分析
为了研究MT对基因表达的影响，作者分析了对照组、MT组、MH组和H2O2组的基因表达谱。结果表明，和对照组相比，在MT组中鉴定到178个DEGs，包括67个下调，111个上调（图4A）。和H2O2组相比，在MH组中鉴定到95个DEGs，包括59个下调和36个上调 (图4B)。DEGs的热图显示了不同组之间的基因表达谱差异（图4C）。
图4 MT对PTr2细胞mRNA表达影响
05
DEGs功能富集分析
和对照组相比，MT组的DEGs显著富集的生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类目分别为整合前病毒潜伏期的建立、宿主细胞质膜和病毒结构组成（图5A）。和H2O2组相比，MH组的DEGs显著富集类目为基于微管的运动（生物过程，BP）、神经元细胞体（细胞组分，CC）和微管运动活性（分子功能，MF）（图5B）。此外，KEGG通路分析显示，MT组上调的DEGs在 Wnt信号通路、TGF-β信号通路、mTOR信号通路中显著富集（图5C，D）。
为了进一步筛选关键基因，使用STRING数据库获得DEGs互作网络，进一步使用Cytoscape中的MCODE和CytoHubba插件获得关键模块和关键基因。和对照组相比，MT组DEGs中，IFI44、ISG15、GBP1、IRG6和IFIT3是关键基因；而与H2O2组相比，MH组DEGs中，PITX2、DKK1和ISL1是关键基因 (图5E、F)。
图5 DEGs的GO、KEGG和PPI分析
06
RT-qPCR验证
为了验证测序结果的准确性，作者选取了6个DEGs（HMOX1、VIM、RBP2、WFDC1、MXI1、PLAG1）进行RT-qPCR验证，结果和测序数据一致（图6）。
图6 RNA-seq与RT-qPCR的基因表达水平比较
07
MT预处理对H2O2诱导PTr2细胞蛋白表达的影响
为了研究MT对H2O2诱导的PTr2细胞氧化应激的影响，作者选取EGR3、PLAG1、MXI1、WFDC1、HMOX1和VIM等6个蛋白进行Western blot分析。如图7所示，与对照组相比，MT组EGR3、HMOX1、VIM和WFDC1蛋白显著上调；与H2O2组相比，MH组EGR3、HMOX1、VIM和WFDC1蛋白显著上调。然而，PLAG1和MXI1的表达水平在MT组显著低于对照组，在MH组显著低于H2O2组。
图7 MT通过诱导蛋白表达保护PTr2细胞免受H2O2诱导的氧化应激
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结 论
综上所述，MT通过减少细胞内ROS生成和细胞凋亡，调节抗氧化相关基因和蛋白的表达来减缓H2O2诱导的PTr2细胞氧化应激。MT作为一种抗氧化候选物，可能在妊娠期保护PTr2细胞免受氧化应激，研究结果有望为MT在妊娠期临床应用的发展提供理论依据，为制定有效的营养策略改善母猪健康提供指导。
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