文献解读|J Allergy Clin Immunol（14.29）：常见变异性免疫缺陷患者的十二指肠炎症改变了对病毒的转录反应

因此，本研究旨在阐明十二指肠微环境在CVID发病机制中的作用，研究十二指肠活检标本的十二指肠转录和蛋白质特征以及细菌微生物区系，特别是与IEL的存在有相关性的。

首先，作者对CVID_IEL、CVID_N、乳糜泻和健康对照组患者的十二指肠标本进行了RNA-Seq分析、蛋白质组学分析和16S（细菌）微生物群分析。统计学发现不同队列之间的年龄或性别没有显著差异，在RNA-Seq 分析中，CVID_IEL组与CVID_N组相比，有更多的肠病患者。所有CVID 患者在活检标本采集时血清 IgA 水平均有所降低。

在RNA-Seq和蛋白质组学方面，CVID患者的十二指肠活检样本聚集在一起，并与IEL的存在无关，而健康对照和乳糜泻形成了单独的簇(图1 A、B)。而在16S rRNA分析中，6名CVID患者(3名CVID_IEL和3名CVID_N)与健康对照组和乳糜泻形成了一个单独的簇(图1C)。

图1

作者在CVID_ALL和健康对照组之间鉴定出7个DEG，在CVID_IEL和健康对照组之间鉴定出30个DEG。比较两个CVID亚组，发现有21个RNA在CVID_N和CVID_IEL之间有不同的调节。将CVID_IEL与确诊的乳糜泻患者进行比较时，发现了16个DEG(图2)。

图2 十二指肠活检标本中 DEGs 的热图比较

(A) CVID-All与健康对照; (B) CVID-IEL与健康对照; (C) CVID-IEL与CVID-N；(D) CVID-IEL与乳糜泻。

作者对从十二指肠活检样本获得的RNA-Seq数据进行了GO富集分析，并比较CVID_ALL和健康对照组的转录调控时，发现与健康对照组相比，CVID患者表现出不同水平的参与细胞对IL-1、脂多糖(LPS)和蛋白质同质二聚活性的反应的因子，而后者参与了两种蛋白质之间的生物物理相互作用，这可能显著影响他们的功能(图3A)。

当他们将更严重的CVID表型CVID_IEL与健康对照组进行比较时，也发现细胞对LPS和蛋白质同质二聚体活性的反应发生改变。此外，与1型干扰素信号通路、免疫反应、对病毒的防御反应、免疫球蛋白受体结合和趋化因子活性/受体结合相关的因子的转录谱发生了变化(图3B)。除了与免疫球蛋白受体结合相关的基因(其转录水平显著低于健康对照组)之外，这些不同调控基因亚组中的大多数在CVID_IEL中的转录水平显著高于健康对照组 (图2B)。此外，与CVID_N相比，CVID_IEL也增加了参与病毒防御反应的转录水平，尽管Hsp90蛋白结合蛋白的趋化因子活性和RNA编码在两个CVID亚组之间也有所不同（图3C）。

当对CVID_IEL和乳糜泻进行GO富集分析时，他们发现与乳糜泻相比，涉及丙酮酸代谢、IgG受体结合和抗原结合的转录谱存在差异(图3D)。

图3 基于RNA-Seq的GO富集化分析

(A)CVID_ALL和健康对照组；(B)CVID_IEL和健康对照组；(C)CVID_IEL和CVID_N；(D)CVID_IEL和乳糜泻。蓝色指的是该途径中的基因数量

接下来，他们使用RNA-Seq数据生成了蛋白质网络。CVID_IEL与健康对照组的蛋白质网络证实了RNA-Seq数据，显示编码LPS反应相关蛋白质的mRNA转录增加。该分析还表明，参与对细菌起源和对含氧化合物的反应的蛋白质转录也增加（图4A）。值得注意的是，由于DEG数量较少，进一步的比较(即CVID-All与健康对照和CVID-IEL与CVID-N)是不可能的。

作者同时应用另一种蛋白质网络-基因组富集分析时，发现乳糜泻活检样本中富集了涉及适应性免疫反应、免疫球蛋白复合物、免疫球蛋白受体结合和抗原结合的因子(图4B)，提示十二指肠粘膜中CVID_IEL中免疫系统的这一部分的功能也降低。

图4 基于DEG富集的RNA-Seq蛋白质相互作用网络

(A)与健康对照相比，CVID-IEL的KEGG途径富集。(B) 左，前3条途径中的蛋白质网络，CVID_IEL与乳糜泻的基因组富集分析。右，相关富集中的基因-概念网络。

接下来，作者基于前述分析结果，将活检样本用液相色谱-质谱联用(LC-MS)法分析了不同组之间蛋白质调节的差异。首先，他们比较了来自CVID和健康对照组的十二指肠活检样本，得到了不同的蛋白质组学特征和清晰的疾病表型聚类 (图1B、图5A)。4种蛋白在CVID_ALL和健康对照组中的表达存在差异:Drebin样蛋白(DBNL) ,TRNA 甲基转移酶11同系物(TRMT11) ,免疫球蛋白重恒定α2（IGHA2）和鸟苷59-三磷酸环水解酶I反馈调节器(GCHFR)等（图5B），这些蛋白参与抗原受体信号传导、甲基转移酶网络和生物蝶呤信号传导等过程。重要的是，IGHA2是十二指肠IgA免疫球蛋白复合物的一部分。

尽管在比较CVID_IEL与对照组或CVID_IEL与CVID_N时没有发现任何不同的调节蛋白（图5B），但他们发现CVID_IEL和乳糜泻之间存在一些差异。在CVID_IEL中下调最多的蛋白是TRMT11、IGHA2、免疫球蛋白J多肽(IGJ)和免疫球蛋白类多肽5(IGLL5)，它们大多与免疫球蛋白调节有关。相比之下，CVID_IEL上调了TRIM3和B-盒及SPRY结构域包含蛋白(BSPRY)的蛋白质水平，这分别与细胞因子调节和干细胞功能有关(图5)。

图5

 (A) DEP热图:与对照组相比，大多数DEP在乳糜泻中的水平较高，CVID中的水平较低。CVID、乳糜泻和健康对照组显示出明显的不同蛋白质水平分布。(B)火山图显示了CVID_ALL与对照组、CVID_IEL与对照组，CVID_IEL与CVID_N，以及CVID_IEL与乳糜泻的蛋白质表达变化。黑点表示统计上有意义的变化，并标注了主要DEP的名称；灰色圆点表示统计学上没有显著调节的蛋白质。

在40个组织样本中，38个样本(19个CVID，10个乳糜泻，9个健康对照)通过了质量控制并进行了微生物成分分析。CVID、乳糜泻和健康对照组之间的α多样性(个体内多样性)没有显著差异(P=0.54)，或者比较两组之间的α多样性时亦如此(CVID与健康对照：P=0.59；CVID与乳糜泻：P=0.38；乳糜泻与健康：P=0.33；图6A)。此外，CVID_IEL和CVID_N的亚组分析显示，各组之间的α多样性没有显著差异(图6B)。

β多样性(即不同分类群在个体或个体群之间共享的程度) 显示CVID和对照组之间 (P=0.58，R=0.05; 图1C)或者CVID_IEL和CVID_N之间均没有显著差异(P=0.32，R=0.06) 。图6提供了P<0.05的细菌分类群,在类水平上比较时，CVID_IEL和CVID_N之间无统计学差异(P=0.17)。

图6

(A)CVID、乳糜泻和健康对照中的α多样性分析; (B) CVID_IEL与CVID_N亚组中的α多样性分析；(C) CVID和健康对照之间分类群的比较; (D) CVID_IEL和CVID_N。

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