文献解读|Exp Mol Med（12.153）：人骨髓间充质干细胞单细胞RNA测序分析及功能亚群鉴定

从健康供体的骨髓分离的第1代MSCs，并且细胞质量较好。MSCs对CD29、CD44和CD105呈阳性，而对CD14、CD34和CD45呈阴性，共捕获6998个细胞并将其分为10个簇（图 1a）。系统聚类分析显示这10个聚类之间关系密切（图1）。以CD14和CD163表达为特征的簇9和10具有不同的RNA谱和相对独立的位置，鉴定为来自骨髓的单核细胞/巨噬细胞，（图1a-b）。第1和第3组标记基因较少的簇，以及没有标记基因的簇 7 和 8，认为是过渡亚群。此外，显示更高水平的干性标志物（包括 SOX4、GAS1 和 DPP4）的簇 2预测为干性亚群，而表现出细胞因子和成骨/脂肪形成因子表达的簇 4 确定为功能亚群 （图1c）。簇5和6都表现出增殖和细胞周期相关基因的表达，但分为两个簇，归类为增殖亚群1和2（图1c）。

图 1. MSCs的scRNA测序确定不同的亚群

为了研究这些鉴定的亚群的可能功能，进行了GO和KEGG分析（图2)。对于生物过程类别，干性亚群的标记基因在炎症反应、脂肪细胞分化、骨骼系统发育和细胞周期的负调控中富集，表明这些亚群具有干性维持和多能性分化的特征（图2a）。对于功能亚群，其标记基因主要在炎症和免疫反应中富集（图2b）。此外，有丝分裂细胞周期的G1/S转换在增殖亚群1的生物过程类别中富集，而有丝分裂细胞周期的G2/M转换在增殖亚群2的生物过程类别中富集，这表明这两个增殖簇在细胞周期中的不同阶段（图2c-d）。

图 2. MSC亚群的GO和KEGG分析

选择簇1-6来构建一个轨迹分支，该分支包含两个末端，分别对应于两个不同的细胞命运（图3a）。如图3b和c所示，过渡亚群1（簇1）和干性亚群（簇2）位于轨迹的根部。此外，增殖亚群均位于细胞命运1。细胞命运2由部分过渡亚群2（簇3）和功能亚群（簇4）组成。细胞增殖相关基因，如MKI67、MCM4和PCNA在细胞命运1中高表达，IGFBP2、CTGF和TIMP3的水平在细胞命运2中上调，但在细胞命运1中下调（图3d）。作者确定了干性亚群和功能性亚群之间的分化关系，分别特征表型CD26+和CMKLR1+来标记。培养7天后，分离的CD26+MSCs的CD26+比率下降，CMKLR1+比率上升。此外，CD26+比率在分离的CMKLR1+ MSCs中较低，并且在培养7天后进一步降低（图3e）。

图 3. MSC亚群的单细胞轨迹分支分析

通过流式细胞术将MSCs分为CMKLR1+ MSC功能亚群和CMKLR1- MSC亚群，包括干细胞和增殖亚群，以进一步研究它们的潜力。结果表明，CMKLR1+ MSC 功能亚群的增殖率低于含有其他 MSC 的群体（图 4a）。与 scRNA 测序结果一致，免疫相关细胞因子，包括 CCL2、TGF-β、IGFBP2 和 PTX3，在 CMKLR1+ MSC 功能亚群中高度表达。此外，成骨和脂肪生成相关因子（如 GREM1 和 CTGF）的表达在 CMKLR1+ MSC 功能亚群中上调（图 4b）。此外，与抑制 PBMC 增殖相关的 CMKLR1+ MSC 功能亚群的免疫调节潜力强于 CMKLR1- MSC 亚群（图 4c）。MSC免疫调节潜力与样品中 CMKLR1+ MSC 的百分比呈正相关（图 4d）。

图 4. CMKLR1+ MSC功能亚群的免疫调节潜能

进一步研究CMKLR1+ MSC 功能亚群的成骨和成脂分化潜能。ARS 染色结果显示 CMKLR1+ MSCs 的矿化水平较高，表明 CMKLR1+ MSCs 具有更强的成骨分化潜能（图 5a）。ALP 染色和定量测定显示一致的结果（图 5b）。相比之下，ORO 染色显示 CMKLR1+ MSCs 中的脂滴比 CMKLR1- MSCs 中的脂滴少，表明进行脂肪形成分化的能力较弱（图 5c）。使用体内模型评估 CMKLR1+ MSCs 的成骨和成脂分化能力。Masson 染色和 H&E 染色均显示CMKLR1+ MSC 组的新骨形成量远大于 CMKLR1- MSC 组，这也通过组织中 OCN+成骨细胞的数量得到证实（图 5d）。如H&E染色所示，CMKLR1+ MSC组的体内脂肪细胞形成较低。此外，CMKLR1+ MSC 组的 Perilipin-1+ 脂肪细胞也较少（图 5e）。

图 5. CMKLR1+MSC功能亚群的分化潜能

使用 AGGR 分析，比较同一 MSC 样本的第 1 代和第 3 代之间的 scRNA 测序数据。新的集群 5 和 8 主要由第 3 代的 MSCs 组成。此外，第 3 代的 MSC 在第 4 和 9 组的包含率高于第 1 代的 MSC。相反 ，第 1 代的 MSC 在第 6、7 和 10 组中占主导地位（图 6a 和 b）。通过筛选10 个簇的标记基因，由 CD14 表达定义的簇 10 鉴定为单核细胞/巨噬细胞。簇 1、5 和 9 的标记基因较少，认为是过渡亚群。以细胞周期相关基因表达为特征的簇 3、6 和 7 确定为增殖亚群。包含SOX4、EGR2和IGFBP1等标记基因的Cluster 2鉴定为干性亚群，CCL2、CTGF和GREM1表达的Cluster 4鉴定为功能亚群。显示 P62 表达的簇 8 是新发现的，主要由第 3 代的 MSCs 填充（图 6c）。第 1 代 MSCs 的增殖率高于第 3 代 MSCs 的增殖率（图 6d）。

有趣的是，第 3 代 MSCs 的成骨分化能力强于第 1 代的 MSCs，但成脂分化试验显示相反结果（图6e）。此外，通过CFSE测定显示的免疫调节潜力在第3代的MSCs中也更强（图6f）。对簇8的标记基因的GO分析显示，该MSC亚群与细胞氧化还原稳态、内质网应激、自噬和生长的负调节有关，表明该簇可能是一个衰老亚群（图6g）。此外，与第1代相比，在第3代的MSCs中观察到更多的衰老细胞（图6h）。

图 6. 不同传代间充质干细胞scRNA测序谱的比较

比较相同传代的两个不同MSC样品（MSC1 P1和MSC2 P1）的scRNA测序数据时，AGGR分析表明两个MSC样品完全分离成两个独立的没有连接的亚群（图7a）。对MSC2 P1的进一步亚群分析显示，鉴定出10个簇，与MSC1 P1的簇数匹配（图7b）。作者鉴定了由DPP4标记的干性亚群、由CMKLR标记的功能性亚群以及由CCNE2和CENPA标记的增殖性亚群1和2（图7c）。尽管MSC2 P1中亚群的标记基因与MSC1 P1中的标记基因并不完全相同，但大多数基因在MSC1 P1和MSC2 P1之间的同一亚群中一致表达（图7d）。此外，在MSC1 P1和MSC2 P1之间，每个亚群的百分比几乎相等（图7e）。

图 7. 不同来源骨髓间充质干细胞scRNA测序图谱的比较

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