文献解读|（10.753）转录组测序和代谢物分析揭示了微塑料和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯对南美白对虾的单一和联合影响

如图1A、1B所示，MPs、DEHP和MPs-DEHP显著激活了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT)。CK组（No pollution group）、MPs组和DEHP（DEHPL和DEHPM）组之间的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性无显著差异。另外,DEHPH和MPs-DEHP显著诱导GSH-Px活性。DEHP显著提高丙二醛（MDA）含量。令人惊讶的是，MDA含量明显受到MPs的抑制，但在MPs-DEHP组中保持在稳定的水平。与MPs相比，MPs-DEHP明显增加过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）含量，显著抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性。MPs-DEHP与DEHP(DEHPM)对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性无显著影响，但与DEHP(DEHPM)比较，MPs-DEHP显著降低丙二醛（MDA）含量。为了进一步研究MPs的存在是否会对DEHP的毒理学效应产生影响，作者选择MPs、DEHP(DEHPM)和MPs-DEHP进行分析。

图1 MPs、DEHP和MPs-DEHP对南美白对虾抗氧化防御机制的影响

为了深入研究MPs、DEHP和MPs-DEHP对南美白对虾的潜在影响，作者对南美白对虾的肝胰腺组织进行转录组学分析。PLS-DA显示，每组有3个生物重复聚类（图2A），表明了组间的显著差异。通过在四组（CK、MPs、DEHP和MPs-DEHP）中进行5种对比（CK/MPs、CK/DEHPM、CK/MPs-DEHP、MPs/MPs-DEHP、DEHP/MPs-DEHP)，与MPs-DEPH相比，DEHP诱导大量的DEGs（差异表达基因），MPs组只有少量DEGs显著改变。

与CK组相比，通过Venn图展示了治疗组的KEGG通路显著改变的数目(图2B)。具体来说，KEGG通路分析显示了MPs组中12条通路均被显著诱导，如戊糖和葡萄糖酸盐相互转化（ko00040，1 DEGs)、花生四烯酸代谢(ko00590，1 DEGs)、PPAR信号通路（ko03320，1 DEGs）。同样，在DEHPM组中23条通路显著变化（图2C），如局灶性粘连(ko04510，11 DEGs)，PI3K-Akt信号通路(ko04151，10 DEGs)和ECM受体相互作用(ko04512，8 DEGs)，相反，在MPs-DEHP组7条显著(p < 0.05)改变的通路中，最具代表性的是嘌呤代谢通路(ko00230, 5 DEGs)、PPAR信号通路(ko03320, 2 DEGs)和AMPK信号通路(ko04152, 2 DEGs)。

图2 组织学分析MPs、DEHP和MPs-DEHP对南美白对虾转录组学的影响

进一步探讨MPs、DEHP和MPs-DEHP DEHP对南美白对虾的生理和代谢的毒理学效应。作者使用UHPLC-MS/MS进行代谢组分析，利用PLS-DA，观察到CK与MPs、DEHPM和MPs-DEHP组之间的显著分离(图3A)，表明南美白对虾用MPs、DEHPM和MPs-DEHP处理后发生了显著的生化改变。此外，共鉴定出1261种代谢物(ESI+和ESI−离子分别为759个和502个)。具体来说，21个(8个上调，13个下调)，82个(52个上调，30个下调)和39个(25个上调，14个下调)。总之，这些结果表明DEHPH和MPs-DEHP处理的南美白对虾代谢水平有明显的波动。此外，DEMs（原位差分电化学质谱仪）来区分MPs/MPs-DEHP和DEHP/MPs-DEHP，其中37个(16个上调，21个下调)和57个(25个上调，32个下调)(图3B)。在MPs、DEHP和MPs-DEHP组中诱导了三种共表达的代谢物(尿苷、壬烷酸和丙酰肉碱)(图3C)。DEMs的KEGG通路富集分析表明，在MPs、DEHP和MPs-DEHP的反应中，DEMs参与了不同的代谢途径。结果表明，MPs显著干扰嘧啶代谢和DEHPH显著改变花生四烯酸代谢、视黄醇代谢、α -亚麻酸代谢、醚类脂质代谢、嘧啶代谢、亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成(图3D)。此外，MPs-DEHP显著影响视黄醇代谢、半乳糖代谢和甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢。

图3 MPs、DEHP和MPs-DEHP对南美白对虾代谢组学的影响

从RNA-Seq中随机选择的9个基因，利用RT-qPCR验证RNA-Seq结果的可靠性。上述选择的基因参与花生四烯酸代谢(CYP2L1)、甘油脂代谢(PNLIPRP1)，嘌呤代谢(PDE3B)，PPAR信号通路(DBI、PCK2)，PI3K-Akt信号通路(HSP90AA1、PCK2)，NOD样受体信号通路(HSP90AA1)和AMPK信号通路(EF2、PCK2)。三个治疗组的RT-qPCR结果和靶基因相对表达水平的转录组分析比较如图4所示。在三个治疗组中，这些基因在RT-qPCR中的表达趋势与转录组分析结果基本一致，说明RNA-Seq结果是可靠的。

图4 RT-qPCR验证DEGs

为了筛选相关的DEGs和DAMs，我们进一步通过Pearson相关系数对DEGs和DAMs进行分析。图5表明为前20位的DEGs和DAMs的相关性，说明DEGs和DAMs的相关性较高。转录组和代谢组的综合分析显示，MPs、DEHP和MPs-DEHP毒理学效应的代谢应答可能分别涉及1、7和4条功能通路。在这些途径中，MPs组中具有代表性的途径是中的甘油磷脂代谢。同样，在DEHPM组中，最明显的途径是嘌呤代谢、赖氨酸降解、血小板活化、氨基糖和核苷酸糖代谢以及神经活性配体-受体相互作用。此外，MPs-DEHP组最丰富的途径是嘌呤代谢和视黄醇代谢。

图5 转录组学和代谢组学的综合分析

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