文献解读|Cell Res(46.297): 垂体神经内分泌肿瘤主要组织类型的蛋白基因组学特征研究

图1 PitNET临床病理分类（2017 WHO）

作者首先对收集患者组织和对照的垂体前叶临床病理特征，包括TF谱系、临床病理亚型、手术侵袭状态、患者性别、肿瘤直径和KNOSP分级进行了总结（图2a）。全外显子测序（WES）数据分析揭示了7333个突变基因，包括11092个非沉默点突变和419个插入或缺失（图2b）。随后作者又分别对蛋白组学、转录组学和磷酸蛋白组学的数据进行了主成分分析（PCA），结果表明PIT1谱系之间（GH、PRL、TSH、silent PIT1和多激素亚型）以及垂体前叶（APG）、ACTH、silent TPIT与其他类型的PitNET之间在蛋白质组学水平上的显著不同（图2c），而PIT1谱系在转录组学和磷酸蛋白质组学水平上显示出与APG组更高的相似性（图2d，e）。因此，这些结果提供了一个多组学景观，以提高对PitNETs分子机制的理解。

图2 PitNET蛋白基因组景观概述

富含PIT1谱系的GNAS是最常见的突变基因，包含两个突变热点，R186C/G/L/H和Q212L（图3a）。GNAS拷贝数增加，对PIT1谱系具有特别强的影响（Spearman相关性）（图3b）。具有GNAS突变或GNAS拷贝数增加在PIT1谱系中显著富集（图3c）。因此，进一步将PIT1谱系分为三个亚组，包括野生型（WT）、GNAS拷贝数增加和GNAS突变体。与WT组相比，携带GNAS突变的样本显示GNAS蛋白水平降低，而GNAS拷贝数增加的患者在mRNA和蛋白质水平上显示GNAS增加（图3d）。进一步，作者比较了GNAS突变体和WT患者的差异表达蛋白，发现参与生长激素（GH）合成、分泌和作用途径（如GH1和GH2）的基因在mRNA、蛋白质和磷酸化水平上调（图3e，f）。另外，GSEA结果显示增殖相关的通路（比如细胞周期和DNA复制）在GNAS拷贝数增加的患者上调（图3h）。此外，与WT组相比，GNAS拷贝数增加组具有更高的多基因增殖评分和临床肿瘤体积（图3i）。在细胞周期相关分子中，PRKDC和CDK6是与GNAS拷贝数正相关的前两个蛋白质（图3j）。为了进一步确认GNAS拷贝数增加的影响，又进行了GNAS和CDK6的免疫组化（IHC）染色并计算得分。在PIT1谱系PitNETs和所有PitNETs中，GNAS得分高组中CDK6得分高的比例大于GNAS得分低组（图3k，l）。总之，这些结果说明了GNAS基因突变可能会导致激素分泌过多的不良事件。此外，GNAS拷贝数增加可以显著增强肿瘤细胞的增殖，靶向CDK6的抑制剂治疗可能对携带GNAS拷贝数目增加的PIT1谱系患者有效。

图3 GNAS突变和GNAS拷贝数增加对PIT1谱系PitNETs的影响

作者对蛋白质组学数据聚类分析，将PitNETs分成七个亚群，包括GHenrich、EMTPRO、PRLenrich、TSH/silent PIT1enrich、ACTHenrich、silent TPITenrich和SF1/NULLenrich（图4a）。其中，SF1谱系和NULL PitNETs聚集在一起，形成SF1/NULLenrich集群，其显示代谢相关途径的上调，包括脂肪酸代谢和柠檬酸循环。此外，男性更普遍，平均年龄更高，肿瘤直径更大。ACTHenrich亚群富含USP8突变，ACTHenrich和silent TPITrich的女性比例极高（图4b）。为了进一步表征PitNETs的蛋白基因组分类，我们对PitNETs的十个临床病理亚型、三个TF谱系和NULL、五个转录组亚群、七个蛋白质组亚群和七个磷酸蛋白质组亚群进行了综合分析。结果表明，使用蛋白质组学数据鉴定的ACTHenrich、silent TPITrich和SF1/NULLrich亚群与使用转录组学和磷酸蛋白质组学的数据鉴定的亚群高度一致（图4c）。

在蛋白质水平上，EMTPRO亚群中止血相关和EMT相关分子（包括GP1BB、FGB、MMP8、FN1和ITGB3）高度表达。EMTPRO亚群中与EMT、通过NFκB的TNFA信号传导和细胞因子-细胞因子受体相互作用相关的通路均上调（图4a），另外，EMTPRO显示出强大的入侵性，具有高水平的KNOSP和手术侵袭，以及较大肿瘤直径（图4b）。接下来使用ESTIMATE算法，EMTPRO在转录组和蛋白组的数据中均显示出较高的Stroml评分（图4d）。通过QuPath生物图像分析定量评估HE染色中具有基质形态的肿瘤细胞的比例，并确认EMTPRO亚群具有最高比例的基质表型细胞（图4e）。进一步通过肿瘤细胞中的上皮标记物（panCK）和间质标记物（FN1）的免疫荧光（IF）共染色，IF结果显示EMTPRO亚群中panCK和FN1共染色的区域的百分比显著高于其他亚群（图4f）。所有这些证据都支持EMTPRO亚群的特征是具有EMT状态的肿瘤细胞。

EMT诱导转录因子（EMT-TFs）被证实为EMT表型的关键驱动因素。作者比较了PIT1谱系中两个转录组亚群（EMTRNA and Hormone）之间的TF mRNA表达水平（图4g），证实了五个EMT-TFs在EMTRNA中显著上调，包括：SNAI1、SNAI2、ZEB2、TWIST1和TWIST2。此外，五种EMT-TFs mRNA的表达在EMTRNA和EMTPRO亚群中均显著正相关（图4h），与Hormone亚群相比，EMTRNA亚群中五种EMT-TFs的转录活性水平更高（图4i）。同样，EMT相关分子包括CDH2、VIM、CD44、FN1和ITGB1在EMTRNA亚群中上调，而CDH1、KRT8和KRT18则在转录组学和蛋白质组学数据集中下调（图4i）。另外，TWIST1和ZEB2的表达与其相应的肿瘤体积和侵袭性之间存在显著的正相关（图4j）。总之，PitNETs的整合蛋白基因组特征鉴定了一个之前未识别的、由EMT定义的高度侵袭性亚群（图4k）。

图4 蛋白基因组学鉴定以EMT为特征的侵袭性亚群

接下来，作者对转录组学数据使用xCell47分析推断肿瘤微环境中不同细胞类型的比例，聚类确定了具有不同免疫和基质特征的四组肿瘤：免疫耗竭、CD4+T细胞浸润、内皮细胞和CD8+T细胞浸润（图5a）。CD8+T细胞浸润簇包含ACTHenrich和silent TPIT亚群富集，其特征在于存在多种免疫细胞类型，包括中央记忆CD8+T和CD8+T（图5a）。在CD4+T细胞浸润亚群中，免疫抑制介质CTLA4上调，提示这些肿瘤可能对免疫检查点相关的治疗有反应（图5a，b）。免疫耗竭亚群由TSH/silent PIT1enrich和GHenrich蛋白质组亚群（主要是PIT1谱系）组成，其特征在于Treg细胞的较高分数和PDL1的上调（图5a，5c）。鉴于其在免疫抑制中的作用，作者进一步探讨了PDL1 mRNA表达与JAK1-STAT1-PDL1相关分子之间的相关性，包括PitNETs中的IFNGR1、EIF4E、JAK1和STAT1（图5d）。正如预期的，这些分子在mRNA、蛋白质和磷蛋白水平上显著正相关。此外， TCR信号相关基因，包括PTPN6、PLCG1和JUN，与PDL1 mRNA表达显著负相关（图5d）。在TSH/ silent PIT1enrich和GHenrich亚群（蛋白质组亚型）和免疫耗竭亚群（免疫亚型）中，PDL1表达显著较高，这与从多组学数据获得的结果一致（图5e）。有趣的是，另一个JAK-STAT轴JAK3-STAT6-FOS/JUN的表达与免疫评分高度相关（图5f）。据报道，STAT6可调节FOS和JUN，FOS和JUN可进一步调节下游趋化因子，如CCL2、CCL5、IL6和TGFB1,53，所有这些都在mRNA和蛋白质水平上与免疫评分显著正相关（图5f，g）。这些发现提示，EMTPRO亚群中趋化因子表达导致的免疫浸润增加可能受到JAK3-STAT6-FOS/JUN轴的调节。在多组学数据中，JAK1/STAT1在PIT1谱系肿瘤和所有Pitnet中均与JAK3/STAT6呈中度负相关（图5h）。

总之，这些数据显示了PIT1谱系中意外的双向调节，包括TSH/silent PIT1enrich和GHenrich亚群中可能对检查点（PDL1和PD1）抑制剂有反应的免疫抑制机制，以及EMTPRO亚群中可能被免疫疗法靶向的机制（图5i）。

图5 PitNETs中免疫浸润特征分析

EGFR与多种人类癌症相关，包括头颈部鳞状细胞癌和肺腺癌，已被提议作为ACTH PitNETs的治疗靶点。作者发现TPIT谱系中EGFR mRNA表达、蛋白质丰度和磷酸化修饰的水平高于其他肿瘤（图6a–c），随后对EGFR相关途径的分析确定了三组显示EGFR激活的不同机制，包括具有USP8突变的ACTH肿瘤（ACTH_USP8突变体）、没有USP8变异的ACTH瘤（ACTH_ USP8 WT）和沉默的TPIT肿瘤（图6b）。在ACTH_USP8突变体组中，USP8功能获得突变将EGFR从泛素化中拯救出来，导致EGFR活性增强，并进一步促进POMC生物合成（图6c，d）。在ACTH_ USP8 WT组中，EGFR配体（即AREG、TGFA、EGF、BTC、EPGN、HBEGF和NRG4）的平均mRNA表达显著高于其他组（图6e），与肽激素生物合成和血清ACTH水平呈正相关（图6f，g）。在silent TPIT肿瘤中，EGFR T693磷酸化、EGFR下游途径或成分（包括PI3K AKT mTOR、MAPK）和细胞周期途径表现出显著的富集（图6h-j），表明EGFR T693磷酸化可能导致这些途径的激活。此外，EGFR的IHC染色显示其在TPIT谱系中的表达高于非TPIT谱系，与ACTH肿瘤相比，在silent TPIT肿瘤中发现EGFR T693磷酸化的阳性染色率更高（图6k）。基于这些结果，作者总结了三种模式中每种模式的潜在治疗选择（图6l）。

图6 TPIT谱系中EGFR激活的三种模式

作者将研究确定的七个蛋白质组亚群的代表性分子特征进行了总结（图7a）。为了评估本研究中观察到的结果是否适用其他队列，作者又在750个PitNETs的独立队列中进行了验证。高肿瘤直径组GNAS突变的比例显著高于低肿瘤直径组，并且高GNAS突变表明预后不良（图7b，c）。这些结果与在200名PitNETs的初始队列中获得的结果一致。对于在初始PitNET队列中确定的EMT-TFs（图4j），在750个PitNETs的验证队列中，ZEB2和TWIST1在侵入组中具有较高的表达（图7d）。此外，在750个PitNETs中，PDL1在TSH和silent PIT1亚型中显示出较高的表达（图7e），支持了在200 PitNET队列中免疫耗竭集群中发现PDL1过表达（图5c）。在750 PitNET验证队列中，与其他谱系相比，EGFR在TPIT谱系中独特地过表达，这也与200 PitNET队列的结果一致（图7g）。EGFR T693磷酸化的IHC染色证实，在TPIT谱系中，silent TPIT亚型中IHC阳性病例的比例（80例中的26例）明显高于ACTH（11例中的0例）（图7h）。此外，silent TPIT亚型中EGFR和EGFR T693磷酸化染色阳性的患者比例（18/80）明显高于其他谱系（1/670）（图7i）。

总之，在初始200个PitNET队列中确定的预后标志物和治疗靶点GNAS、ZEB2、TWIST1、PDL1、EGFR和EGFR T693磷酸化在750个PitNET队列的相应亚型中得到了验证。这些发现总结在PitNET树中，该树显示了一种更新的分子分类，其中患者被明确地分为七个亚群，用于潜在的治疗选择（图7j）。

图7 750名PitNETs独立队列中标记物的验证分析