文献解读|J IMMUNOTHER CANCER（13.751）：通过高通量单细胞测序从肿瘤中直接鉴定新生抗原特异性T细胞受体

使用这种方法需要解决的技术难题就是鉴定获得的新生抗原特异性TCRs的能力。由于TCR具有极高的多样性和复杂程度，多达三分之一的成熟T细胞还可能表达两个功能TCRα链，传统的T细胞克隆和Sanger测序人工成本高、耗时长，技术难度大。此外，用于治疗的TCRα和β链必须完全正确配对，以减少脱靶效应。因此，该研究旨在开发一种更加高效、准确的方法，直接从肿瘤标本中分离新生抗原特异性TCRs。

该研究使用illumina NextSeq 550测序系统，该系统更加快速、简约和经济，能快速、完整实现外显子组和全基因组测序。单细胞测序使用10X Genomics Chromium Controller获得TCR组库信息，并从测序数据中直接拼接TCR全长。

本研究开发了从肿瘤标本中直接识别新生抗原特异性TCRs的新方法。之前的方法：（1）肿瘤组织切小块，在较高浓度IL-2的培养基中培养约4周，以扩增肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TILs）的数量；（2）进行了大规模筛选，以确定新生抗原特异性的TIL和相应的新生抗原；（3）基于阳性筛选结果，用负载新生抗原的树突状细胞（Dendritic cells，DCs）特异性刺激对应TILs，然后进行低通量的单细胞全转录组分析；（4）从单细胞全转录组测序数据中分离出TCR部分序列。

与之前的方法相比，本研究改进了以下关键步骤：（1）从肿瘤标本中直接分离TILs；（2）为降低单细胞测序相关的成本，先进行了新生抗原特异性筛选，以减少用于后续分析的新生抗数量；（3）用负载新生抗原的DCs刺激TILs，并进行高通量单细胞测序分析；（4）为了提高敏感性，富集目的T细胞后进行单细胞测序。

切除晚期黑色素瘤患者体内的转移瘤制备TILs细胞悬液，并按方案培养。负载给DCs的新生抗原肽为64种非同义突变，通过测量IFN-γ初步筛选阳性的新生抗原肽。基于初筛阳性结果，对特异性T细胞进行单细胞测序，同时获得IFN-γ和IL-2的表达水平，以及TCR序列。如图1所示黑色素瘤1号患者，经抗原肽刺激后，共有26个单细胞表达高水平IFN-γ。进一步分析单细胞测序数据，从这些IFN-γ+单细胞中识别出6种不同的TCRs（图1）。

为了鉴定这些TCRs的特异性，需要合成全长TCRs，然后将其转导到患者外周血中分离的自体T细胞中。TCR转导T细胞与含有14个25mer突变肽的自体DC共培养，通过IFN-γ ELISA检测，所有6个TCR都无法识别野生型抗原肽，但是可以识别纯化的突变肽。

图1  从黑色素转移癌瘤患者切除的转移瘤中分离新抗原特异性TCRs

切除转移性结直肠癌患者的转移瘤，将肿瘤标本分离成单细胞悬液并冷冻保存。由于从标本中测序得到的非同义突变较少，没有初筛肽库阳性的T细胞。分选CD4+PD-1+和CD8+PD-1+ T细胞群，使用相同的方法学与负载新生抗原肽的DCs共培养后进行单细胞测序。转移性结直肠癌1号患者TILs经过不同新生抗原肽库刺激后，表现出不同程度IFN-γ分泌，并且有一个T细胞刺激后高水平表达IL-2。

根据单细胞测序结果，共获得4个共有的TCR和36个独特的TCR，将其中全部共有TCR和前7个独特TCR合成全长检测对于肽段的反应性，检测的所有TCR均表现出对突变肽具有更高的反应性，而对野生型基本无反应性（图2）。

图2  ELISA测定T细胞分泌IFN-γ

TILs的TCR克隆型具有高度多性，通常只有很少有T细胞可以被检测到。因此在既往单细胞研究中，为了更准确地评估TCR克隆型的频率，多个来源的T细胞测序数据会组合分析。

将每个患者的单细胞测序数据合并，获得该患者所有的TCR特征绘制饼图。其中高频的TCR克隆型（>1%）用彩色标记，其余频率较低的TCR均为灰色，同时文字标出新生抗原特异性TCR的编号及频率。新抗原特异性TCR克隆型只占整TILs的一小部分（0.01% ~ 0.30%）。TCR1是最常见的克隆型，但其频率仅为0.30%，在该患者单细胞测序数据中分离出15个细胞，其中只有5个在TMG-1刺激分泌IFN-γ。虽然该TCR为新生抗原特异性克隆型，但具体到每一个细胞，可能存在多种分化和表型特征，尤其是其中处于“耗竭”状态的细胞，无法对特异性刺激做出正常免疫反应。

与之前低通量的研究方法相比，分泌IFN-γ的新生抗原反应T细胞的频率在四个肿瘤标本中从更高。但是需要强调，在长期的肿瘤片段培养过程中，一些新抗原反应T细胞可能扩增更加明显，因此原有方法可能具有更高的新抗原反应T细胞的比例。

图3 新抗原特异性TCR克隆型的频率