文献解读|Ultrason Sonochem（9.336）：转录组和代谢组联合分析揭示超声波处理促进糙米发芽的机制

超声波处理种子的发芽率呈现时间依赖性增加趋势（图1A）。超声波处理30 min，发芽24 h和30 h时，发芽率最高，在30 h时发芽率为100%，而对照组发芽率约为77%。此外，超声处理20，30和40 min，发芽36 h，发芽率均达到100%，显著高于对照组（图1B）。因此，在随后的实验中，将不作超声处理，发芽36 h的种子作为对照组（CK）；用超声处理30 min，发芽36 h的种子作为处理组（UT）。

图1. 超声波处理对糙米发芽率的影响

通过非靶向LC-MS对UT和CK组进行代谢谱分析，检测到1057种代谢物。PCA分析将UT和CK组明显分为两个集群（图2A），PC1占差异的88.6%，表明UT和CK组的代谢谱存在差异。同样，相关性分析显示UT和CK样本间可有效区分（图2B），这表明代谢组学数据高度可靠，UT和CK组的代谢特征显著差异。

差异代谢物分析鉴定了498个DAMs，其中422个上调，76个下调（图2C）。DAMs显著富集的KEGG条目（图2D）是嘧啶代谢、嘌呤代谢、ATP结合盒式蛋白转运（ABC转运）、β-丙氨酸代谢、精氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、磷酸戊糖途径、泛酸和CoA生物合成。值得注意的是，498个DAMs分为10个以上的亚类，主要是氨基酸、肽类和类似物、碳水化合物和碳水化合物结合物、脂肪酸和脂肪酸结合物（图2 E）。这些DAMs与能量代谢有关，在糙米发芽过程中具有重要的功能，这可能是超声波处理提高糙米发芽率的原因。

图2. UT和CK代谢谱分析

转录组测序共得到111783141个raw reads（UT：58374438；CK：53408703）和111189574个clean reads（UT：58064007；CK：53125567）。参考基因组比对结果表明: UT和CK组的总比对率分别为94.94%和94.38%，唯一比对率分别为90.35%和89.89%。主成分分析显示，UT和CK组内生物学重复紧密聚集，组间明显分离（图3A）；相关性分析表明UT和CK组间存在差异（图3B）。差异表达分析共鉴定到867个DEGs，其中638个上调，229个下调（图3C，D）。

图3. UT和CK之间的转录组分析

GO分析结果显示：DEGs主要富集在代谢过程，其次为催化活性，细胞和细胞部分。和结构分子活性、氮素利用、节律过程和细胞增殖等GO条目相关的DEGs相对较少。

在圆形功能富集图（图4B）中，最里面的圆圈显示了前20个显著富集的KEGG通路；第二个圆圈表示该通路中的背景基因数和Q值；第三个圆圈表示上调和下调基因的百分比；最外面的圆圈代表每个通路的富集因子，最显著富集的KEGG通路是代谢通路（map 01100）、次级代谢物生物合成通路（map 01110）、苯丙酸类生物合成通路（map 00940）、氨基糖和核苷糖代谢通路（map 00520）、淀粉和蔗糖代谢通路（map 00500）和光合作用通路（map 00195）。

为了深入了解DEGs在种子萌发过程中的动态变化，基于log2FPKM值进行聚类分析，将DEGs分为两个主要聚类（图4C）。聚类1包括593个从CK到UT表达水平增加的基因，表明它们与糙米发芽正相关。这些DEGs编码八个转录因子（图4D），即ARR-B、NAC、bHLH、AP2-EREBP、ABI3、GRAS、C3H和HB，负责调节糙米发芽相关基因的表达。聚类2中的206个基因在超声处理后表达水平下降。

图4. DEGs的GO、KEGG和聚类分析

为了验证RNA测序数据的准确性，RT-qPCR验证了12个与水稻种子萌发相关的DEGs，包括编码SPS、SUS、RBCS、GDCH、NADP、Sub 1B、MYB和An-1的基因。PCR结果表明：UT组中12个基因的表达水平均显著高于CK组（图5），这与转录组测序结果一致，表明测序数据的可靠性。

图5. RT-qPCR验证12个DEGs

首先，超声波处理使聚合物降解成低聚物和单体释放出大量的能量。其次，DEGs和DAMs参与碳代谢和TCA循环，为种子萌发提供能量。最后，转录因子如ARR-B、NAC、bHLH和AP 2-EREBP家族通过调控基因表达进一步促进萌发（图6）。

图6. 超声波处理对糙米发芽率影响的作用机理。绿色代表代谢物，热图表示每种代谢物的相对含量（黄色代表下调，绿色代表上调）；红色代表酶；基因表达水平用热图表示（蓝色代表下调，红色代表上调）。