English文献解读|Cancer Res（13.31）：外周血中PD-1+的T细胞扩增培养后与肿瘤浸润淋巴细胞具有更高相似性
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论文ID
：T Cells Expanded from PD-1+ Peripheral Blood Lymphocytes Share More Clones with Paired Tumor-Infiltrating Lymphocytes
译名：外周血中PD-1+的T细胞扩增培养后与肿瘤浸润淋巴细胞具有更高相似性
期刊：Cancer Research
影响因子：13.31
发表时间：2021.04.15
DOI：10.1158/0008-5472.CAN-20-2300
背 景
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）是指浸润在肿瘤内部，针对多种肿瘤抗原的T细胞。其中，新抗原特异性T细胞可以转化成相关细胞治疗产品，治疗晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌等。这些新抗原特异性T细胞也可以从患者的外周血淋巴细胞（PBL）中分离，尤其在PD-1+ T细胞群中比例较高。但是目前新抗原特异性T细胞的整体频率低、细胞少、鉴定难度较大，临床应用依赖于大规模的体外扩增。
本研究通过高通量测序，证明PBL中PD1+ T细胞群体与配对TIL的相似性高。进一步证明所用方法学可以高效快速得分离和扩增PD-1+ PBL中新抗原特异性T细胞。最后证实该方法获得的新抗原特异性T细胞，可以联合PD-1单抗，用于其他治疗方式失败的晚期肿瘤患者。
实验设计
结 果
01
分离培养PBL中T细胞并且进行体外扩增和检测
对患者进行体内或者体外PD-1单抗治疗后，分离患者外周血PBL，以PD-1作为分选标志物，分选阴性群和阳性群细胞群体并且进行扩大培养。分选获得的PD-1+和PD-1-细胞群体分别在培养的2-3周指数级增长，并且阴性群具有更高的增长速率（图1左），最终获得的扩增性T细胞中CD4或CD8单阳细胞约占所有细胞的90%（图1右）。
图1 左：细胞增殖曲线；右：箱图分选后培养得到的两群细胞的表型特征
02
抗PD-1治疗后，PBL中PD-1+抗原特异性TCRs克隆性扩增
抗PD-1疗法不仅增加了患者外周PD-1+ PBL的频率，而且提高了增殖性PD-1+ PBL（Ki-67+PD-1+）的比例，表明抗PD-1疗法增强了PD-1+ PBL的增殖，与既往文献报道一致。此外，从同一患者治疗前后的PD-1+ PBL，发现抗治疗后 PD-1+ PBL的体外扩增明显更快（图2）。
图2 流式细胞检测PD-1和Ki-67
03
PBL中PD-1+的扩增性T细胞为肿瘤反应性T细胞
将T细胞与配对肿瘤细胞共培养，并且检测T 细胞分泌IFNg的能力。PD-1-群培养得到的克隆性CD8+ T细胞不表达IFNg；PD-1+ PBL扩增的CD8+ T细胞中在用自体肿瘤细胞刺激后分泌IFNg细胞群体频率增加。同时，在CD4+亚群中观察到类似的结果。进一步对另外18种不同组织来源的肿瘤样本进行相同的检测，在不同的癌症类型中，从PD-1+ PBL体外扩增的CD8+和 CD4+ T细胞亚群都富含自体肿瘤反应性T细胞。
04
PBL中PD-1+的扩增性T细胞与配对的TIL共享更多的克隆
TIL（未进行体外扩增培养）含有肿瘤反应性T细胞克隆，但是其中大部分靶向未知抗原。因此，确定TIL的TCRβ（T-cell receptor-b）库、并且探究TIL与外周T细胞TCRβ库的特征非常重要。
未进行培养的TIL和从体外分选培养的T细胞，分别提取总RNA , 使用5RACE扩增方案，在Illumina HiSeq X10系统上进行高通量测序，测序数据使用ImmuHub TCR进行分析。分析过程利用国际免疫遗传学信息系统（http://www.imgt.org），定位TCR的V、D、J和C基因片段。测定了TCRβ的CDR3的核苷酸和氨基酸序列，并从已鉴定的TCRβ库中删除了具有框外和终止密码子的序列。增加“共享CDR3相同氨基酸序列的TCRβ克隆的数量”，进一步衡量两个不同来源T细胞的相似性。“共享TIL克隆型”，是指从PBL扩增的T细胞和配对TIL中均发现的克隆，“非共享克隆”，是指仅从PBL扩增的T细胞中发现，而在配对TIL中没有的克隆。
在不同肿瘤中，PD-1+ PBL扩增的T细胞在共享TIL克隆约为平均为11.29%（图3），远高于PD-1- PBL扩增的T细胞。此外，根据频率找到高频前50的TCR克隆，比较三群TCR的特征可以发现，前50克隆中，PD-1+PBL扩增的T细胞与配对的TIL之间拥有更多共享克隆（图4）。
图3 共享和非共享TIL克隆型的比例
图4热图展示不同细胞频率排序前50的克隆占比
05
临床应用
招募了4名多线治疗失败并产生抗PD-1获得性耐药性的患者，使用从PD-1+ PBL扩增的自体T细胞和抗 PD-1抗体联合治疗。3名患者出现客观缓解，并且没有不良事件，没有发生与治疗相关的死亡。
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结 论
既往很多文献表明PD-1+细胞群体中拥有更多的肿瘤新抗原特异性T细胞，但是对于患者配对的外周和肿瘤组织中PD-1+细胞群体的关联、相似性、抗原反应性等缺乏进一步阐述。本研究就该问题设计了更为细致的实验，从PBL中以PD-1为分选标准，探究两群细胞的构成，并且成功培养分选后细胞，并且对两群细胞的增殖潜能、抗原反应性、与TIL克隆的相似性进行探讨。最终通过利用PD-1+的PBL中获得的新抗原特异性T细胞对患者治疗，获得较好的临床结果
本研究建立了一种高效、快速获得PD-1+ PBL中克隆性T细胞体的方法。同时表明，PD-1+ PBL培养获得的T细胞与配对TIL的TCRβ库更为相似，并且从PD-1+ PBL扩增的T细胞是肿瘤抗原反应性T细胞比例可能更高。这些细胞有望用于临床治疗，尤其是对于其他治疗方式无效，或者已经产生免疫检查点治疗耐药的晚期肿瘤患者。
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