文献解读|Aging Cell（7.8）：健康个体的原代皮肤成纤维细胞的转录组揭示了与年龄相关的 mRNA 和长非编码 RNA

随着年龄的增长，全身细胞基因表达程序的变化反映在组织和器官的衰老表型上。随着衰老的进展控制细胞功能的RNA和蛋白质的相关机制尚未完全阐明，希望能够揭示健康衰老和年龄相关疾病的过程。

研究者团队从GESTALT队列中收集的82名健康个体的活检组织中建立并培养了原代皮肤成纤维细胞（表1），然后从这些皮肤成纤维细胞中提取总RNA，进行RNA测序(RNA-seq)（图1a）。在与人类基因组比对、标准化和定量之后，转录组谱分为编码[信使RNA (mRNA)]和线性或环状长非编码RNA (lncRNA)；然后，采用线性和样条模型来识别差异表达的转录本，并使用 GSEA 和 长非编码RNA富集分析(LncSEA)方法寻找与差异表达的 RNA 相互作用的分子（图1a）。

使用线性回归模型，他们发现在该队列中表达的 16455 个 mRNA 中，有 1437 个随着年龄的增长而发生显著变化（图1b）。在少数减少的 mRNA 中，包含环指跨膜结构域的蛋白 2 (RNFT2) mRNA，编码抑制白细胞介素 3 (IL3) 信号传导的蛋白质，以及WNT11 mRNA（编码一种在年老的老鼠肝脏中含量较少的蛋白质，与衰老有关）（图1c）。他们鉴定出1436个mRNA随年龄的差异表达，只有少数不随年龄线性变化的mRNA。这些mRNA包括丰度斜率在50岁后增加的mRNA ，包括编码基质AAA肽酶相互作用蛋白1 （MAIP1，也称为C2ORF47）、淋巴管内皮透明质酸受体1 (LYVE1)和RNA结合基序蛋白24 (RBM24)的mRNA，或在50岁后减少的mRNA ，包括编码ⅴ型胶原α 3链(COL5A3)、轴蛋白2 (AXIN2)和二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的mRNA（图1d-e）。

表1. 参与研究的统计数据

图1. 衰老过程中差异表达的编码转录本

他们发现差异表达的mRNA（beta系数）与差异表达的蛋白质（年龄beta）随着年龄而变化（图2a）。他们通过识别差异表达的 mRNA来扩展此分析，其中编码的蛋白质水平没有显著变化（图2b）。相反，他们鉴定了差异表达的蛋白质，其编码 mRNA 的水平没有显著变化，发现 830 和 1029 个此类蛋白质分别增加或减少（图 2c）。值得注意的是，他们发现了先前与寿命相关的转录因子(TF)，如热休克因子1 (HSF1)、叉头盒A [FOXA;也称为肝细胞核因子3 (HNF3)]和配对盒4 (PAX4)，在健康队列中随着年龄的增长而显著富集（图2d），这表明它们可能会调节几种差异表达mRNA的转录。

此外，他们还发现了几个 FOX 成员（FOXJ1、FOXJ2 和 FOXD3）（图 2e），以及 HOX 成员包括HOXA4、TGFB 诱导因子同源框 (TGIF)、pre-B -细胞白血病同源盒1（PBX1）、HNF6（也称为OC-1）、HNF1A、MSX-1和垂体特异性正转录因子1（PIT1，也称为POU1F1），它们的转录调节因子随年龄的变化而变化（图2f）。

基于基因集差异表达分析(GSEA), 他们发现尽管这些转录因子属于两个主要家族，FOX（图2g）和HOX（图2h），但每个因子都有独特的转录靶点，证明了健康的衰老需要大量差异表达转录物。

图2. 转录因子 (TF) 可能随着年龄的增长而驱动差异丰度 mRNA 的表达

接下来，他们总共鉴定了 11570 个 lncRNA，其中800个随着年龄的增长而丰度存在差异（图3a）。作为年龄函数的顶级差异表达线性lncRNA（线性模型）的特征很差（图3b），无论用线性还是样条回归分析，大多数lncRNA的丰度随着年龄的增长而变化，其中少数在50岁后斜率增加（图3c）或减少（图3d），因此只能使用样条回归分析来检测。

图3. 差异表达的线性lncRNA随着年龄变化

值得注意的是，这些 TF 共享 lncRNA 靶点，因此可能意味着这些线性 lncRNA 受到多个 TF 的转录调节，并且随年龄的变化（图4a）。通过线性回归分析，他们发现了几个与RNA剪接相关的蛋白，包括聚C结合蛋白(PCBP2)，核内不均一核糖核蛋白C (HNRNPC)和RNA结合基序蛋白15 (RBM15)，随着年龄的增长而优先富集（图4b）。图4b显示了通过LncSEA平台进行的交联分析中已知与RNA结合蛋白(RBP) 相互作用的升高和降低的lncRNA（图4c-d）。他们利用RT-qPCR分析验证了5个注释后升高的lncRNA的水平（SOCS2-AS1、LINC00595、ZFHX4-AS1、A2M-AS1和INHBA-AS1）（图4e）或减少的水平（MIAT, THBS4-AS1, MIR600HG, KDM4A-AS1和LINC00926）（图4f）。

图4. 能够转录的TF和能够结合线性lncRNA的RBP且随着年龄的增长而丰度变化

为了完成差异表达RNA的表征，他们评估了环状lncRNA (circRNA)随年龄的差异表达。在这个circRNA库中，监督的偏最小二乘法(PLS)分析显示，基于队列中的circRNA标签，不同年龄组之间存在明显的差异（图5a）。线性回归分析显示，随着年龄的增长，47个circRNA升高，37个circRNA降低（图5b）。

在考虑相对丰度，显著性和年龄的beta系数之后，他们使用RT-qPCR分析在年轻（<35岁）和年老（>70岁）的捐献者中，重点验证了每组中排名前5的circRNA，以及共享相同前体转录本的同源线性mRNA（图5c）。在老年人中升高的circRNA中，他们成功验证了3个表达水平随年龄增加的转录本，即hsa_circ_0055019、hsa_circ_0067682和hsa_circ_0128535（图5d），而hsa_circ_0078226、hsa_circ_0001610、hsa_circ_0000591和hsa_circ_0071106在老年供者中显著较低（图5e）。

本项研究鉴定培养的原代皮肤成纤维细胞中存在的编码和长非编码 RNA，这些原代皮肤成纤维细胞收集自 82 名不同年龄段（22-89 岁）的健康个体。使用高通量 RNA 测序和线性回归模型，他们鉴定了 1437 个编码 RNA (mRNA) 和 1177 个线性和环状长非编码 RNA，它们的丰度随着年龄的变化而存在差异。GSEA揭示了参与协调差异丰度 mRNA 子集转录的精选转录因子，而LncSEA则鉴定出预计参与年龄相关lncRNA谱的RNA结合蛋白。总之，这项研究报告了健康人类皮肤成纤维细胞的整体转录组、编码和非编码与年龄相关的变化，并提出这些转录本可以作为衰老皮肤的生物标志物和治疗靶点。