Affinity Map：光催化化学蛋白质组学，一次给全蛋白质组测出 Kd

一句话结论：给药物/内源分子量结合亲和力，过去要么"纯化蛋白逐个测"，要么"只在特定酶类或热稳定蛋白上测"。Nature Communications 这篇 **Affinity Map** 把**光催化标记 + 竞争结合 + 高通量质谱**三者拧成一个通用平台——小分子、线性肽、环肽、抗体通吃，细胞裂解液、器官提取物、活细胞表面都能测，直接给出全蛋白质组级别的 Kd。

做药、做靶点的都懂一个痛点：配体和蛋白的亲和力（Kd），决定了它在细胞里到底"抓"谁、抓多紧。 可现实是——

- 找靶点，靠蛋白质组/转录组数据"定性猜"，误差大；

• - 验证亲和力，得把蛋白一个个纯化出来，或用工程化报告系统，通量低、覆盖面小；
• - 想在全蛋白质组层面量亲和力，现有方法要么只覆盖激酶（如 Kinobeads），要么依赖蛋白热稳定性变化（CETSA / 2D-TPP / LiP / PELSA），对膜蛋白和活细胞基本"失明"。

Affinity Map 想做的，就是补上这块空白：一个不加修饰、适用于各类非共价配体、各类蛋白靶点、各类生物样本的通用量亲和力平台。

一、原理：把光催化标记变成"全局放射配体竞争"

Affinity Map 的核心思路很巧妙（图 1）：

• - 用光催化剂偶联的探针（基于 µMap 体系）去标记蛋白；
• - 标记强度正比于"光催化剂探针占据了结合位点"的程度；
• - 当加入竞争配体（你真正想测的分子）时，标记信号会随浓度剂量依赖性下降；
• - 把"标记信号 vs 探针/配体浓度"的关系，套进标准竞争结合动力学建模。

▲ 图1Affinity Map 平台总览。光催化亲和标记（photocatalytic affinity labeling）结合竞争配体结合模型，实现" modality-agnostic "的 Kd 全局定量——相当于把经典的放射配体竞争实验，升级成带蛋白质组级别读出的版本。

换句话说，它不需要纯化蛋白、不需要蛋白有热稳定性变化、也不挑膜蛋白还是可溶性蛋白，本质上就是一个"全蛋白质组版的放射配体竞争 assay"。

二、小分子实战：达沙替尼，一次画出 28 个激酶的 Kd

先用经典抗癌药达沙替尼（dasatinib）验证平台（图 2）。

• - 在 K562 裂解液中，Affinity Map 对达沙替尼测出 Kdapp 覆盖 28 个激酶及多个其他靶点；
• - 实验设计很"重"：100 pM – 10 µM 的配体动态范围，每个靶点用 48 个不同条件、技术重复，n = 96；
• - 和金标准方法对比：与 Kinobeads 的激酶结合亲和力相关性极显著（简单线性回归 p < 0.0001），也能和 CETSA 互为印证；
• - 更省样本——仅需 400 µg 蛋白，约为同类文献用量（1.2 mg）的三分之一。

▲ 图2｜小分子在裂解液中的亲和力 profiling。A：用各探针浓度下的 EC50 反推游离配体与 Kdapp；D：多种探针下达沙替尼亲和力谱对比；E：火山图展示富集蛋白（按实测亲和力着色）；F–G：Affinity Map 测得的 log2(FC) / 亲和力，与 Kinobeads 高度相关；H：达沙替尼激酶靶点（Affinity Map vs Kinobeads vs CETSA）三方比对。

三、选择性验证：JQ-1 只抓 BRD，氟马西尼只抓 GABA 受体

平台不是"只认小分子"。图 3 用两个硬核案例证明它的选择性分辨力：

• - (+)-JQ-1（溴结构域抑制剂）：Affinity Map 在 K562 裂解液中清晰显示其选择性结合 BRD 家族蛋白；并用独立体外活性实验（PhosphoSens）验证了 RIPK1（3.0 vs 3.6 µM）、CSNK1D（4.1 vs 3.6 µM）等靶点的亲和力，数值高度吻合；
• - 与等温滴定量热法（ITC）测得的亲和力一致，说明平台给出的 Kd 是"真 Kd"；
• - 氟马西尼（flumazenil）：在小鼠脑膜提取物（器官提取物的代表）中，精确命中 α/γ GABA 受体（PDB 6X3U），证明它能搞定膜蛋白 + 原代组织。

▲ 图3｜(+)-JQ-1 的亲和力 profiling。A：用体外活性实验验证 RIPK1 / PKN3 / CK1D 等靶点及亲和力；C：[(+)-JQ1] 依赖性地降低 BRD4 生物素标记；E：K562 中 JQ-1 选择性结合 BRD 蛋白；F：Affinity Map vs ITC 一致性；G：人肝 S9 中的亲和力谱；H：氟马西尼在小鼠脑膜的亲和力与 α/γ GABA 受体对接结构。

四、肽类也不落下：从 Smac、SOS1 到 HIV 信号肽

肽是药物里难搞的一类（柔性大、无热稳定性信号）。Affinity Map 直接上手（图 4）：

• - 合成的碘乙酰胺探针偶联肽段，覆盖内源肽（ncORF、酶解片段）以及来自有序/无序区的肽；
• - 测出 Smac 来源的 IAP 结合肽段、SOS1 衍生肽等主要互作物的亲和力；
• - 还能对 HIV-1 gp160 信号肽、SNHG6 lncRNA ORF、STAT 上游 ORF 等内源肽段给出亲和力——这是传统热稳定性方法根本碰不了的。

▲ 图4｜K562 裂解液中的线性肽亲和力 mapping。A：探针合成策略与所选肽段类型（内源 / 有序区 / 无序区）；B–C：Smac IAP 肽段、SOS1 衍生肽的亲和力谱；D–F：HIV-1 gp160 信号肽、SNHG6、STAT uORF 等内源肽段的亲和力。

五、活细胞表面：环肽 RGD 与 IgG 的真实结合

最惊艳的是——它能在活细胞表面直接测亲和力（图 5），不再依赖裂解：

• - 环肽 cyclo-RGDfK：在活 U87MG 胶质瘤细胞（24 块 6 孔板同时做）上测亲和力，结果特异性命中整合素 β3（ITGB3），与已知的 αVβ3 异二聚体选择性完全吻合；
• - IgG：在活 THP-1 悬浮细胞上，亲和力谱清晰指向多个 Fc 受体（如 FCGRIIB，测得 2.9 µM，与文献 8.3 µM 同量级）。

▲ 图5｜环肽 RGD 与 IgG 在活细胞表面的亲和力 mapping。A：活 U87MG 上 cyclo-RGDfK 特异性结合整合素 β3（αVβ3）；B：活 THP-1 上 IgG 命中多个 Fc 受体。两步都直接在完整活细胞、含血清培养基中完成。

六、为什么这件事值得做蛋白组学服务的人关注

把 Affinity Map 的能力拆开看，它正好踩在 chemoproteomics 服务的几个痛点上：

1. 通量 × 覆盖兼得

   ：一次实验同时"找靶点 + 测 Kd"，且不受限于激酶或热稳定蛋白——小分子、肽、抗体、膜蛋白、活细胞全涵盖。

2. 样本友好

   ：400 µg 起始蛋白即可，对临床样本、原代组织、稀缺样本尤其友好。

3. 动态范围宽

   ：100 pM – 10 µM，覆盖绝大多数治疗性 / 内源配体的亲和力区间。

4. 可量化、可比对

   ：用 MS 读出的全局竞争模型，和 Kinobeads、CETSA、ITC 等金标准相互印证，结果"拿得出手"。

对提供蛋白质组学 / 化学蛋白质组学外送服务的团队来说，这类"通用亲和力 profiling"很可能成为继靶标鉴定之后，下一个客户会主动要的增值项——当客户不只问"我的分子结合谁"，还问"结合多紧"时，平台型方法就是答案。

*本文基于 Nature Communications 论文《Affinity Map: …》整理