文献解读|J Hazard Mater (13.6)：基于iTRAQ和PRM研究低镉条件下水稻根质膜蛋白在锌胁迫中的潜在作用

镉(Cd)污染已对作物生长发育、食品安全和人类健康造成严重威胁，潜在危害着农业和全球环境。锌(Zn)已被用于降低土壤和植物中Cd的积累。位于质膜(Plasma membrane，PM)上的蛋白质在植物逆境信号传递中发挥着重要作用。为进一步阐明低镉条件下PM蛋白如何调控Zn/Cd转运，本研究采用定量蛋白质组学技术在蛋白质组水平鉴定并验证差异表达蛋白(DEPs)及其生物学功能。

该团队从对照组(CK)和Cd2+、Zn2+处理(T)的水稻根系提取的PM蛋白样品中共鉴定到14326个独特肽段和4008个蛋白质，其中2997个为DEPs，占鉴定到的总蛋白质的74.8%。与对照组相比，当T/CK的比值大于1.20或小于0.83时，共有514个DEPs，占鉴定到的DEPs的17.2%。然而，当T/CK的比值大于1.50或小于0.66时，有332个DEPs，占鉴定出的DEPs的11.1%，其中192个DEPs在Zn/Cd处理中与对照组相比上调，140个下调。利用各组样品之间蛋白表达量的差异倍数和T检验得到的P值共同绘制火山图，用来表征CK与处理组之间的显著性差异(图 1)。

图1 火山图

对不同处理的DEPs进行系统聚类分析，结果如图2所示。分析的6个样品包括CK和处理组(T)的各3个重复。从图2可以看出，CK和Zn处理样品的每3个重复分别聚类在一起，具有较高的可重复性。同时，在水稻根系中，CK和Zn处理样品的蛋白质表达丰度和表达水平的多样性具有显著差异。

图2 对不同处理的DEPs进行层次聚类分析

为了解释蛋白质的功能和本研究涉及的生物学过程，进行蛋白质富集的功能注释。利用Blast2Go软件(http://www.blast2go.de)对鉴定到的差异蛋白进行生物学过程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和细胞组分(Cellular Component，CC)分析。然后对DEPs进行GO功能富集分析，通过Fisher精确检验找到DEPs富集的功能类别(图 3)。从图3A可以看出，17个BP中DEPs的主要类型为代谢过程和细胞过程；7种MF的主要类别为催化活性和结合功能；13个CC中最主要的类型为细胞部分、膜部分、细胞、膜和细胞器。DEPs的功能富集分析结果可以直接揭示所有DEPs的整体功能富集特征，而这些显著富集的GO条目往往涉及研究者最关心的生物学功能。在本研究中，GO富集分析显示这些蛋白主要参与水稻根中的代谢过程(25.0%)和细胞过程(23.8%)。此外，从图3B可以看出，与对照相比，Zn处理显著影响了BP中参与L-蛋氨酸补救、甲硫腺苷L-蛋氨酸补救和L-蛋氨酸生物学合成过程。此外，鉴定结果表明，大多数蛋白质主要存在于PM中，PM蛋白对重金属胁迫非常敏感，在响应重金属胁迫、缓解重金属毒害作用方面发挥着重要作用。

图3 对所有鉴定到的蛋白进行GO功能富集分析

在生物体中，蛋白质并不是独立地执行其功能的。相反，不同的蛋白质相互协调，共同完成一系列的生化反应，以执行它们的生物学功能。因此，通路分析是系统、全面地了解生物过程，以及疾病的发生机制和药物作用机制最直接、最必要的途径。对显著差异表达蛋白进行KEGG通路注释分析，可以帮助我们了解这些蛋白参与的代谢或信号通路，展示蛋白从细胞表面到细胞核的一系列变化过程，解释参与该过程的一系列生物学事件和效应因子。通过Fisher精确检验对DEPs进行KEGG通路分析(图 4)。从图4A可以看出，与植物代谢相关的DEPs主要参与谷胱甘肽代谢、苯丙素生物合成、光合生物的碳固定、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及丙酮酸代谢等。富集分析发现，在重金属处理下，铂类耐药性、α-亚麻酸代谢、钙重吸收的内分泌等因子调控、囊泡运输中的SNARE相互作用、类黄酮生物合成、ABC转运蛋白和赖氨酸降解均存在显著差异。

图4 A, KEGG通路；B, KEGG通路富集分析

此外，参与Zn2+和Cd2+转运的7个DEPs在GO分析和KEGG通路中得到注释。其中，4个DEPs (A2XQ09、B8AAT9、B8AB68、B8BN76)参与氧化磷酸化，4个DEPs (A2XQ09、B8AAT9、B8AB68、A2XPS1)具有质子转运ATP酶活性。此外，B8B248、B8BN76和A0A1B1ELU7参与了重金属离子的结合和转运。PPI网络分析显示，在鉴定到的7个DEP中，有5个是相互作用的(图 5)。所有这些功能表明，鉴定的PM蛋白在调控重金属离子的跨膜转运、抵御重金属胁迫和缓解重金属对植物的毒害等方面发挥着非常重要的作用。后续该团队又通过PRM分析验证iTRAQ筛选到的具有潜在离子转运功能的候选蛋白。

图5 DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络

本研究探究低Cd条件下水稻根系PM蛋白响应Zn胁迫的差异变化及参与Zn-Cd转运的DEPs的响应机制。结合iTRAQ标记技术和PRM靶向蛋白组学定量验证技术，进行DEPs的高通量筛选和验证。通过上述研究，可以得出以下结论：低Cd条件下，Zn和Cd之间仍存在交互作用；在蛋白质水平上共鉴定出14326个独特肽段和4008个蛋白质，通过GO功能富集分析与KEGG通路分析，发现主要的BP、MF和CC，谷胱甘肽代谢和苯丙素生物合成通路显著富集；7个参与Zn/Cd转运的PM蛋白(其中包括4个经PRM验证的蛋白)在维持水稻正常生长、调控重金属离子跨膜运输、抵御重金属胁迫以及缓解重金属对水稻的毒害等方面发挥着重要作用。总之，本研究为水稻根部重金属胁迫下蛋白生物标志物的筛选及抗重金属胁迫的解毒机制研究提供了重要的指导价值。

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