文献解读|Cancer Cell（44.5）：将细胞类型解析的转录组谱与胰腺癌患者生存率联系起来

过去几十年，大规模转录组测序技术使得对肿瘤样本进行广泛的分析成为可能，研究人员得以将基因表达模式与患者的临床结局联系起来。这种方法已成为肿瘤学的基石，通过将分子发现与真实世界的预后意义联系起来，连接了基础研究和临床验证——这一范式至今仍广泛应用。近年来，随着人们对肿瘤微环境（TME）的关注日益增加，人们现在普遍认识到，肿瘤由多种细胞群组成，非恶性细胞也通过转录组重编程参与肿瘤发生和患者生存。然而，先前积累的大多数包含匹配临床信息的测序数据集都是在大规模水平上生成的，这使得大众无法解析细胞类型特异性的基因表达，也无法研究其与患者预后（尤其是长期生存结局）的关联。

在接受手术切除的3103例患者（称为FUSCC-surgPDAC队列）中，收集了547例肿瘤样本进行后续分析。这些样本经进一步评估RNA完整性后，进行单细胞核转录组分析(snRNA-seq)。最终，在152例经病理确诊的胰腺导管腺癌 (PDAC)样本（称为FUSCC-snPDAC队列）获得了高质量的单细胞分辨率转录组数据，并附有匹配的随访信息（图1A，图S1A-C）。FUSCC-snPDAC队列的临床病理特征与原始FUSCC-surgPDAC队列相似。FUSCC-snPDAC队列中的所有样本均来自未经治疗且接受手术切除的患者。值得注意的是，FUSCC-snPDAC 队列中有 80.3% 的患者在完成随访后达到临床终点（死亡），这一比例远高于大多数现有的计算机模拟PDAC 队列，如 TCGA-PAAD (48.6%)（图 S1D），这确保了本研究中预后分析的稳健性和可靠性。

研究团队对1203189个单细胞核进行无监督聚类分析，鉴定出五种主要细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、内皮细胞、免疫细胞和内分泌细胞（图 1B；图 S1E）。利用经典谱系标记，将这些主要类别进一步细化为 23 种主要细胞类型。导管细胞根据已知标记和拷贝数变异分析，分为PDAC-导管细胞（恶性）和非PDAC导管细胞（导管-1、移行腺泡-导管化生和胰腺上皮内瘤变）（图S1F-1I）。既往研究已建立了与细化细胞亚群相关的独特基因特征。通过系统的生存分析，他们发现其中许多特征与患者的总生存期（OS）显著相关。例如，血管生成相关巨噬细胞和TXNIP+经典B细胞与较差的总生存期相关，而IL21+滤泡辅助性T细胞和LC样树突状细胞(DC)则与较好的预后相关（图S1J）。这些发现表明，细胞类型特异性的转录组模式与患者预后密切相关。

为了进一步研究细胞类型解析的转录组谱与患者OS之间的关联，他们分析了每个样本中每种细胞类型的平均标准化基因表达量。最初，获得了841823个细胞类型-基因特征对，随后对其进行筛选，仅保留在至少 50% 的样本中存在的特征对，最终得到 130454 个保守特征。为了确保结果的稳健性，他们应用了一种额外的标准化方法，即使用每百万转录本（TPM）转换后的表达数据，该方法与主要方法高度一致（图 S2 A）。使用 Cox 比例风险回归，他们鉴定出 7248 个与至少一种细胞类型的患者 OS 显著相关的细胞类型解析预后基因（crPRG）。后续的逐步多变量 Cox 回归分析显示，其中 67.6% 的细胞类型-PRG 特征与临床病理变量无关，这支持了它们作为独立预后生物标志物的潜力。其余特征与已确立的预后指标[包括 TNM 分期、神经周围浸润和淋巴血管间隙浸润 (LVSI)]表现出显著的共变性（图 S2 B-C）。

在所有crPRG中，49.5%仅与较长的OS相关（LS），41.9%仅与较短的OS相关（SS）。正如预期，虽然PDAC导管细胞携带的SS和LS-PRG数量最多，但其他TME细胞类型也携带大量高度细胞类型特异性的PRG，重叠极少（图2A；图S2D-E）。值得注意的是，所有血管内皮细胞类型（动脉、静脉和毛细血管样细胞）均表现出偏向于与较短OS相关的PRG（图S2F）。虽然三种血管内皮细胞类型共有一个核心内皮转录组程序，但每种亚型中的大多数PRG都是独特的，重叠有限。仅有七个基因（DUSP6、RPL37、CYR61、TAGLN2、HMCN1、VAPA和ETS2）与所有血管内皮细胞类型的短期生存相关，而STXBP1（一种 Weibel-Palade 小体胞吐和血管稳态的关键调节因子）是唯一与长期生存始终相关的基因。与血管内皮细胞不同，三种内分泌细胞类型（胰岛 α、β 和 δ 细胞）的 PRG 值偏向于更好的预后（图 S2 G）。

此外，619个基因在不同细胞类型中表现出双向预后效应（定义为双向预后基因）。双向预后基因的鉴定有助于指导药物靶点的选择，因为单个可靶向基因在不同的细胞类型中可能发挥相反的作用，从而潜在地影响治疗效果。例如，CD44在PDAC细胞和CAFs中的表达与较差的预后相关，而其在T细胞中的表达则与生存期的延长相关（图2B，图S2H），这与其在基质/肿瘤细胞中已知的促肿瘤作用以及在T细胞中的免疫支持功能相一致。类似地， ITGB1在PDAC细胞中预测较差的预后，但在T细胞中预测较好的生存期（图S2H）。ITGB1在癌细胞中的促肿瘤作用已得到充分证实，它能促进细胞增殖、侵袭和耐药性。18在此，他们发现 ITGB 敲除 (KO) 显著降低了CAR-T细胞的肿瘤内浸润，表明 ITGB1 对 T 细胞的抗肿瘤功能和肿瘤内持久性至关重要，从功能上验证了其作为在癌细胞和 T 细胞中发挥相反作用的双向 PRG 的分类（图 S2I-K）。ADAM17虽然如先前报道的那样与 PDAC 细胞的不良预后相关，但在 DC 中却显示出保护性关联（图 S2 L），提示其抑制可能损害 DC 的功能。作为启动 T 细胞的关键细胞类型，他们假设 DC 中的 ADAM17 可能影响肿瘤特异性抗原呈递。用ADAM17抑制剂处理负载OVA的DC会损害其启动OT-1细胞的能力，酶联免疫斑点(ELISpot)和CellTrace Violet(CTV)示踪实验证实了这一点（图S2M-P），表明ADAM17抑制对DC的抗肿瘤功能有害。鉴于ADAM17抑制剂（例如Aderbasib；NCT04295759，NCT01254136）的疗效有限，未来的研究应评估其在治疗过程中对DC功能和抗原呈递的潜在影响。

即使接受根治性手术，仅有少数PDAC患者能够存活超过五年，称为长期生存者（LTS），而许多患者在术后一年内死于该疾病，称为短期生存者（STS）。为了在细胞类型分辨率下识别与LTS相关的基因特征，他们采用二分法将snPDAC队列中的患者分为LTS组（总生存期>5年）和STS组（总生存期<1年），并进行了跨细胞类型的差异表达分析（图2E）。在应用基于Cox回归分析的更严格的阈值后，他们鉴定了830个保守的、差异表达的细胞类型基因特征（图2F）。

在LTS中显著上调的402个保守特征中，33%来源于内分泌细胞类型，例如β细胞SCGB2B2和α细胞SNRPN（图2G）。他们鉴定出CXCL17，这是一种在PDAC导管细胞中表达升高的趋化因子，与LTS相关，这与结肠癌和子宫内膜癌的初步报道一致。

在STS中，428个细胞类型基因特征显著上调，主要在PDAC导管细胞和毛细血管样内皮细胞中表达（图2G）。值得注意的是，他们在PDAC患者的导管细胞中观察到HLA-G（一种免疫抑制性非经典MHC分子）的高表达，这与之前的报道一致，并通过免疫组化（IHC）在PDAC队列中得到验证。此外，他们发现毛细血管样内皮细胞中分泌因子（如SERPINA1和ANGPT2）的表达上调，这些因子可能通过旁分泌信号促进PDAC的增殖和侵袭。总的来说，这些细胞类型特异性基因特征具有为临床决策提供信息的潜力：STS 相关特征可能有助于识别不太可能从直接手术中获益的患者，这些患者可以考虑接受新辅助治疗，而 LTS 相关特征可能有助于选择立即进行根治性切除的候选者。

鉴于细胞间通讯在肿瘤进展中的关键作用，他们对STS和LTS PDAC中的各种细胞类型进行了配体-受体（LR）相互作用分析。与LTS组相比，STS组肿瘤在多种细胞类型中均表现出显著更高的LR相互作用频率（图3A）。

在STS肿瘤中，内皮细胞和周细胞（血管周围壁细胞）以及CAFs表现出更强的外向相互作用信号，而PDAC细胞主要作为信号接收器（图3B ）。如既往研究所述，周细胞和内皮细胞均参与ECM的生成，导致ECM优先沉积于血管周围区域。相应地，在STS样本中，源自内皮细胞和周细胞的ECM-受体相互作用显著增强，指向PDAC导管细胞。这种血管相关ECM的富集可能通过黏着斑机制为PDAC细胞的早期血管侵袭创造有利的微环境，STS样本中较高的LVSI发生率也支持了这一观点。为了进一步探究哪些PDAC表型与血管结构存在空间关联，他们绘制了胰腺导管细胞的转录异质性图谱（图3C），并鉴定出13个功能基因模块。其中，与“代谢激活”、“细胞外基质相互作用”、“基底样”和“神经调节”相关的基因模块与较差的OS相关，而与“脂肪酸氧化”、“经典样”、“上皮液体/离子转运蛋白”和“细胞间连接”相关的模块则与较好的OS相关（图3D）。空间转录组分析表明，基底样转录特征优先定位于血管结构附近（图3E-F），这与先前报道的该亚型的侵袭性行为相符。在该基底样模块的基因中，黏着斑通路是富集程度最高的通路。通过多重 mIHC 证实了 PDAC 腺体结构与邻近血管之间存在黏着斑，并且在基底样 PDAC 细胞中关键的黏着斑蛋白 paxillin 过度表达（图 3 G）。

CAFs是PDAC肿瘤微环境中最丰富的基质细胞类型，广泛参与纤维化基质的形成，并增强肿瘤细胞的恶性表型。为了研究CAF来源信号对PDAC细胞的影响，他们进行了NicheNet分析，以评估CAF表达的上游配体对PDAC细胞基因表达的调控作用。总体而言，与LS-PRG相比，SS-PRG显示出更高的调控潜力，并且更容易受到CAF来源配体的正向调控（图3H）。

为了研究PDAC中细胞类型特异性PRG的空间组织及其与治疗反应的相关性，他们应用Xenium in situ-5K（一种单细胞分辨率的空间转录组分析技术）对29例接受或未接受新辅助治疗的PDAC组织样本进行了分析。分析涵盖了视野（FOV）中的3110831个细胞，其中45.5%来自未治疗的样本，54.5%来自接受新辅助治疗（化疗/化疗联合免疫疗法）的病例，并根据RECIST标准将其分类为部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）（图4 A）。使用包含5095个基因的panel，基于经典标记物，通过无监督聚类分析鉴定了20种主要细胞类型。值得注意的是，与SD样本相比，PR样本中PDAC导管细胞特异性SS-PRG显著下调，证实了治疗诱导的预后相关转录组的调控。这一发现在一个公开的snRNA-seq队列（N = 43）中得到了独立验证，其中来自治疗反应良好病例的PDAC导管细胞表现出比反应不良肿瘤更明显的SS-PRG抑制。

基于这些预定义的细胞类型解析的PRG，他们进一步将每种细胞类型细分为LS和SS相关亚型（图4B）。细胞间距离分析显示，与LS细胞类型相比，某些SS细胞类型表现出不同的空间偏好（图S7B）。例如，SS-PDAC细胞距离LS-CAF、LS-内分泌细胞和LS-非PDAC导管细胞更远，但距离其SS对应细胞更近（图4C）。细胞邻域（CN）分析鉴定出19个具有独特细胞组成的CN（图4D）。在接受化疗免疫治疗的PDAC中，免疫富集的微环境CN0和CN4的比例有所增加。与单纯化疗相比，联合免疫疗法降低了CN15的比例。CN15是一种富含CAF的CN，其中LS-CAF的比例高于SS-CAF，这表明治疗诱导了CAF的转录组重塑。相反，化疗联合免疫疗法组的CN12比例增加，CN12富含髓系细胞。接下来，他们比较了不同治疗反应的PDAC中CN的比例。正如预期的那样，免疫富集的CN，特别是CN0、CN4和CN18，在PR样本中升高（图4 D），这与既往研究报道的与良好预后相关的炎症表型一致。值得注意的是，主要由SS型PDAC细胞、CAF和巨噬细胞组成的CN6在PR病例中显著降低（图4 D-F）。对这三种 SS 型细胞群的空间 LR 分析进一步揭示了 PR 样本中 SS-CAF 与 SS-PDAC 之间的通讯减少（图 4 G），包括由胶原蛋白、CD99、CXCL、THY1 和 JAG1-NOTCH2 介导的相互作用（图 4 H），这表明其在化疗耐药性中可能发挥作用。

为了系统地绘制 SS 和 LS 细胞类型的空间分布图，他们计算了中心细胞类型与其最近邻细胞的平均距离，并分析了10-200 μm径向距离内（步长 = 10 μm）靶细胞的密度（图 4 I）。在所有距离发生变化的细胞类型对中，他们观察到，在 PR PDAC 中，与 SD PDAC 相比，SS 肿瘤内神经与 SS-PDAC 细胞的距离显著更近，而与 LS-PDAC 细胞的距离则较近，这表明神经微侵袭可能导致治疗反应不佳（图 4 J-K）。相反，LS 周细胞经常位于 10–50 μm 距离的 LS 淋巴管内皮细胞 (LEC) 附近，这是 PR PDAC 的特征性空间分布模式。虽然周细胞在淋巴管中的功能作用尚不明确，但这种LS型周细胞-淋巴内皮细胞（LEC）微环境可能反映了淋巴管整合程度更高，有利于免疫细胞浸润，从而可能增强治疗效果。总而言之，这些发现表明，预后分层细胞类型的空间组织会随治疗动态改变，并可能作为治疗反应的指标。这提示，基于细胞类型的预后分层基因不仅可以预测长期生存，而且具有指导治疗策略的潜力。

为了方便临床和肿瘤研究界获取细胞类型解析的预后信息，他们开发了一个交互式网络工具 ctPANDA（图 5A）。ctPANDA 支持在三个层级上选择细胞类型，从主要谱系（1 级）到主要细胞类型（2 级）再到精细化的细胞聚类（3 级）。除了基本的基因表达数据外，ctPANDA 还提供了一个界面，用于探索细胞类型解析的蛋白质/代谢活性与患者OS之间的相关性。蛋白质活性[仅限于转录因子 (TF)]是使用 ARACNe-VIPER 工作流程推断的，该工作流程评估 TF 的功能状态，而不仅仅是依赖于其 mRNA 表达水平。这种方法可能更好地捕捉 TF 的预后相关性——例如，虽然PDAC 细胞中的HIF1A mRNA 与不良 OS 的相关性很弱，但其推断的蛋白质活性却表现出更强的预后相关性（图5B-C）。同时，通过scFEA工作流程计算得到的HIF1α驱动过程，例如PDAC导管细胞中的丙酮酸向乳酸的转化和乳酸的积累，与患者生存率降低相关（图5D-E）。这些发现验证了ctPANDA作为研究细胞类型分辨率下预后相关特征的可靠框架。

为了进一步验证在 ctPANDA 中鉴定的非 TF cr-PRG 在蛋白水平上的生存相关性，他们采用选择性方法选取了六个代表性靶点，并通过 mIHC 染色证实了它们的预后意义（图 5F）。mIHC 结果显示，ANGPTL4 在 α-SMA+ FAP+CD31− CAF 中、DUSP6 在 CD31+内皮细胞中、NDRG1 在CD45+ CD68+Mono/Macro 中以及 PPP2R2C 在 KRT19+导管细胞中与不良预后相关；而 MCTP2 在 CD45+CD3+T 细胞中以及 IGF1R 在 SYN+内分泌细胞中与良好预后相关。这些结果在外部 PDAC 队列（云南队列）中通过相同的 mIHC 染色和分析程序得到证实。

传统的整体预后分析无法解析治疗靶点在不同细胞类型中的作用，即抑制一种细胞类型中的促肿瘤机制可能会破坏其他细胞类型中的抗肿瘤活性。为了克服这一局限性，他们应用ctPANDA分析了SS-PRG在不同细胞类型中的分布，以寻找在多种细胞类型中均与不良预后持续相关的靶点。在所有SS-PRG中，PLOD2和P4HA1与最多的细胞类型相关（图6A）。最近的一项研究表明，P4HA1不仅通过其在肿瘤细胞中经典的促ECM作用促进肿瘤进展，而且还通过损害T细胞干性来促进肿瘤进展。这与观察到的肿瘤细胞和T细胞中P4HA1高表达与不良预后相关的现象相符。与P4HA1相比，PLOD2在PDAC导管细胞和CAF中表现出显著更高的HR值，而导管细胞和CAF是PDAC的主要细胞成分。

作为赖氨酰羟化酶家族成员，PLOD2 在PDAC中与HIF1A在组织和细胞类型水平上均呈正相关并共表达。在体外缺氧条件下，PLOD2 在肿瘤细胞和非肿瘤细胞类型中均上调表达，并且在体内缺氧区域呈空间富集。为了验证 PLOD2 表达与总生存期 (OS) 在蛋白水平上的关联，他们使用 FFPE 样本对 PDAC 队列进行了IHC分析。结果一致，在肿瘤富集区域和基质富集区域中，PLOD2 高表达均与较差的预后相关。此外，PLOD2在先前定义的 CN6 区域呈空间富集，该区域与较差的治疗反应和较高的缺氧评分相关。比较分析显示，PLOD2在 SS 型 CAF、PDAC 导管细胞和单核细胞/巨噬细胞（CN6 的核心细胞成分）中表达显著增加。基于径向距离的空间分布分析证实，PLOD2 在以 SS 型 CAF、PDAC 导管细胞和单核细胞/巨噬细胞为中心的微环境中过表达，且这种过表达存在于不同的距离区间。

PLOD2介导的胶原蛋白赖氨酸羟基化调节原纤维交联和细胞外基质（ECM）刚度，这是PDAC的标志性特征之一。鉴于PLOD2在PDAC组织中的广泛表达，以及其在多种细胞类型中与不良OS的持续相关性，他们假设非选择性抑制PLOD2可以显著抑制肿瘤进展。为了实现PLOD2的高效降解，他们致力于开发一种蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）——一种双功能分子，由靶标结合配体、E3泛素连接酶配体以及促进靶蛋白通过泛素-蛋白酶体系统降解的连接子组成。通过对包含共计1635125个小分子候选物的两个化合物库进行虚拟筛选，他们选择了排名前99个的化合物，并使用表面等离子共振（SPR）进行实验验证。其中三个化合物对PLOD2表现出很强的结合亲和力，并且具有适合PROTAC设计的分子量和化学性质。以这些分子为靶标，他们设计并合成了七种PROTAC分子。其中，PROTAC-G3（其E3泛素连接酶配体为TRIM21）对PLOD2的降解作用最强且特异性最高，这已通过Western blot实验证实（图6 B-C）。值得注意的是，在TRIM21敲除细胞中，PROTAC-G3对PLOD2的降解作用消失（图6 D）。全蛋白质组学分析进一步表明，PROTAC-G3对PLOD2具有高度特异性。

随后，他们在患者来源的异种移植（PDX）模型中评估了PROTAC-G3的抗肿瘤活性。PROTAC-G3治疗显著缩小了肿瘤体积并减少了基质含量（图6 E-F）。然而，在PLOD2-KO肿瘤细胞和CAFs生成的异种移植瘤中，PROTAC-G3并未显示出显著的抗肿瘤作用。为了进一步验证其在免疫功能健全环境下的疗效，他们采用了CD34 +人源化小鼠模型（图6 G）。使用GA化学修饰的siRNA进行跨物种基因敲除以及PROTAC-G3治疗均能有效抑制人PDAC CFPAC-1异种移植瘤的生长（图6 H-J）。值得注意的是，在整个研究过程中，各治疗组小鼠的体重保持相近，表明该治疗方案具有良好的耐受性。为了进一步研究PLOD2降解对肿瘤微环境（TME）的影响，他们对携带PDX模型的huPBMC人源化小鼠的肿瘤组织进行了单细胞转录组分析（scRNA-seq）。进一步分析显示，治疗组的CD8+ T细胞表现出更高的肿瘤反应性评分，而肿瘤细胞的增殖能力降低，CAF的炎症潜能略有增加。综上所述，这些临床前结果表明PROTAC-G3是一种概念验证化合物，并展示了ctPANDA如何促进抗肿瘤靶点的筛选和验证。

本研究整合了152例PDAC患者的单细胞多组学数据和纵向数据，分析了120万个细胞，构建了一个将细胞类型特异性基因表达与总生存期联系起来的预后图谱。利用单细胞分辨率的空间转录组平台，进一步分析了310万个细胞，并将其与治疗反应关联起来。为了赋能转化研究群体，本研究开发了ctPANDA，一个提供细胞类型水平预后信息的交互式平台。该图谱将PLOD2鉴定为一个有前景的靶点，其高表达预示着八种细胞类型中较差的预后。本研究开发了一种概念验证化合物，该化合物能够有效降解PLOD2并抑制体内PDAC的进展。总的来说，这项研究将预后分析从整体水平推进到细胞类型分辨率，建立了一个将基因表达与临床结果联系起来的框架，并为靶点发现和精准肿瘤学提供了可操作的见解。