文献解读|Nat Commun（14.7）：人类胃肠道间质瘤的基因组和转录组图

胃肠道间质瘤(GIST) 是最常见的肉瘤，通常起源于胃或小肠。大多数 GIST 是由KIT (75–80%) 或PDGFRA (5-10%)中的激活突变引起的。GIST在临床上具有异质性，在个体患者中表现出不同程度的疾病侵袭性，一些低风险病变多年保持稳定，而另一些病变则迅速发展为广泛转移性疾病。揭示导致侵袭性 GIST 发展的分子变化可能为 GIST 生物学和治疗策略提供启示。最近，已有研究利用细胞遗传学方法和全外显子组测序 (WES) 对一小部分 GIST 患者进行了研究，报告了 GIST 中DEPDC5 (17.5%)、DMD (66%)、MAX (32%)、SETD2（11.2% 的高危 GIST）和SDH (9.0%) 10的复发性体细胞变异。目前缺乏对 GIST 的系统性全基因组和转录组研究。

研究团队对 49 名患者的 59 个 GIST 和 49 个匹配正常样本进行了 WES分、全基因组测序 (WGS)和全转录组测序 (WTS)分析。共鉴定出 1729 个编码单核苷酸变异 (SNV) 和小插入/缺失 (indel)，涉及 1282 个基因。编码突变率中值为每兆碱基 (Mb) 0.67（范围为 0.15-1.70）（图 1a），与低突变率癌症相当，例如嫌色性肾细胞癌和慢性淋巴细胞白血病。此外，与 TCGA 报告的其他 6 种肉瘤类型相比，GIST 的肿瘤突变负担最低。

与 SNV 和插入/缺失稀少不同，他们观察到 GIST 基因组中拷贝数变异 (CNV) 的负担更高。在整个队列中，总共鉴定出 2126 个拷贝数增加片段和 6246 个拷贝数丢失片段，相当于基因组的平均 19%（范围为 0-78%）（图 1a）。此外，他们检测到 336 个体细胞结构变异 (SV)，每个样本的 SV 事件数量范围为 0 到 39（图 1a）。随着风险水平的增加，肿瘤的体细胞编码突变、CNV 和 SV 的总数（或分数）也增加（图 1b-c），表明在 GIST 进展过程中积累了越来越多的改变。基因组复杂性（TMB、CNV 负担）的增加与肿瘤大小和有丝分裂过程呈正相关。此外，克隆分析表明，克隆和亚克隆编码突变在原发性“高风险”GIST和转移性 GIST 中均增加（图 1c），而在高风险/转移性 GIST 中，亚克隆编码突变比克隆编码突变积累更多，表明侵袭性 GIST 更加异质性。

在本研究的队列中成功鉴定了已报道的 GIST 驱动基因的功能性改变，包括KIT、PDGFRA、NF1、SDHA、DMD、 RB1、CDKN2A和SETD2（图2a）。然而， MutSigC2V平台预测KIT和YLPM1为显著突变基因。KIT突变主要位于外显子 11、9、13 和 17（图 2a-c）。发现了KIT的一个原发性外显子 9 突变 (A502_Y503insFA) ，该突变具有获得功能特性，对一线和二线 TKI（伊马替尼和舒尼替尼）均敏感。KIT和PDGFRA突变是互斥的（图 2a）。值得注意的是，在本研究队列中，YLPM1 （含 YLP 基序的蛋白 1）是KIT后突变最频繁的基因（图 2a）。所有YLPM1突变都是整个长度的蛋白质截短突变，表明其具有肿瘤抑制因子的潜在作用（图 2c）。在一例KIT/PDGFRA野生型 GIST 中，发现了一个预测有害的SDHA错义突变 (R585Q, NM_004168)（图2a）。SETD2中的所有突变均为失活突变，主要发生在高风险/转移性 GIST 中（图 2a）。他们在一例高风险 GIST 中发现了一个预测有害的错义突变（图 2a）。

除了这些已验证的GIST驱动基因外，他们还鉴定了5个反复突变的基因（≥3例），包括RYR2（6％）、ARID1A（4％）、KIAA1109（4％）、CENPF（4％）和DNAH11（4％）。ARID1A已列入癌症基因普查（CGC v90）。所有ARID1A突变都是截短的（移码突变或无义突变），显示出潜在的肿瘤抑制作用（图2a）。这些数据表明，GIST在突变水平上表现出相当大的异质性，可能是由KIT / PDGFRA突变引起的。GO分析显示，这些突变基因在7个生物学过程中富集：蛋白质磷酸化（KIT、PDGFRA和NF1）、染色体组织（YLPM1、ARID1A和SETD2）、稳态过程（RYR2）、细胞分化调节（KIAA1109）、水解酶活性调节（DEPDC5）和细胞周期（RB1和CENPF），表明这些生物学过程的异常参与了GIST的发病机制（图 2a）。

为了深入了解GIST的病因和突变过程，他们试图破译体细胞突变目录中的突变特征。当仅包括编码区时，WGS和WES之间96个突变类别的突变谱显示出高度相关性，这反映了不同测序平台和亚组之间的一致性。当包括非编码突变时，相关性显著下降，C>A颠换突变减少，而T>C和T>A突变增加。这些结果表明编码区和非编码区的突变过程不同。有趣的是，KIT的突变谱（主要是T>A、T>C）占所有编码SNV的3.7%，与整个突变目录的分布（C>T、C>A）完全不同（图 2d）。KIT的 T > A 突变主要在 GpTpT 背景下富集，这可能与特定的诱变过程有关。

在WES/WGS队列中通过Sanger测序验证了体细胞YLPM1纯合突变（SNVs和缺失），通过基因组定量PCR验证了体细胞YLPM1纯合缺失，并通过IGV推断了缺失区域（外显子1 ~ 4）。YLPM1突变在胃 GIST 中更为常见。当 YLPM1失活突变存在于原发性肿瘤中时，它会在随后的转移性 GIST 中持续存在（图3a）并且当存在于任何转移性病变中时，也会在同一患者的其他转移瘤中检测到。在 68 名患者中的 42 名 (61%) 检测到 YLPM1 CNV（图2a）。14q 染色体杂合缺失是 GIST 中最常见的基因组事件之一。人类YLPM1位于 14q24。14q 染色体杂合缺失可能是造成频繁缺失的原因。在9 名患者中 (13%) 发现了纯合YLPM1突变和缺失（图 2a）。YLPM1的基因组改变与端粒长度相关，这与先前的研究一致，即 YLPM1 参与端粒维持。在 TCGA Pan-Cancer Atlas 计划中，253 个非 GIST 肉瘤（3%）和 10953 个泛癌症（3%）中仅偶尔观察到基因组YLPM1畸变，显著低于 GIST 中的频率，表明YLPM1失活选择性地发生在 GIST 中。

他们进一步通过免疫印迹法在 64 例患者的 73 个 GIST 中分析了 YLPM1 在蛋白质水平上的失活频率。无论是否有KIT或PDGFRA突变，64 名患者中 31 名（48%）均证实 YLPM1 蛋白丢失（图 3b）。32% YLPM1 表达缺失患者归类为低风险或中等风险（图 3b-c）。然后，他们进行了免疫组织化学检测以验证 YLPM1 蛋白表达缺失的频率。组织微阵列验证队列中 47%的 GIST 为 YLPM1 表达阴性，其中包括 75 个低风险或中等风险（图 3e），这表明 YLPM1 失活可能是 GIST 发病机制中的早期事件。YLPM1的基因组改变与蛋白质表达相关。鉴于YLPM1 在蛋白质水平上的失活频率高于在基因组水平上的失活频率，他们检测了启动子高甲基化是否导致YLPM1失活。WTS 数据和 DNA 甲基化研究表明，DNA 甲基化失调在 GIST 中 YLPM1 表达调节中并不常见。在 GIST 中也发现了类似的高频率的 DMD 蛋白质丢失和相对较低的DMD基因组变化频率，表明 GIST 中存在非基因组失活机制。非基因组机制（例如转录后修饰）是否导致低风险 GIST 中的 YLPM1 蛋白质丢失值得进一步研究。

利用多种GIST模型研究了YLPM1的生物学功能。他们使用CRISPR/Cas9系统从保留YLPM1表达的GIST-T1细胞中建立了YLPM1敲除(KO)细胞。YLPM1 敲除促进了短期和长期测定中的细胞生长和增殖。相反，在YLPM1KO 同源 GIST-T1 细胞 (GIST-T1YLPM1 KO) 中重新表达 YLPM1 会降低活细胞数量（图 3 f-g）和增殖特性（图 3 h-i）。

为了确定 GIST 中 YLPM1 失活调控的整体基因表达模式，他们对配对细胞系[YLPM1 敲除(KO) 的 GIST-T1 YLPM1 KO， YLPM1 恢复的 GIST-T1YLPM1 KO）进行了转录组分析(RNA-seq)。基因集富集分析 (GSEA) 显示，细胞周期相关基因，包括有丝分裂纺锤体基因，在GIST-T1YLPM1 KO 细胞中上调，而凋亡相关基因在 YLPM1 恢复的 GIST-T1YLPM1 KO细胞中正向富集（图 3m）。与干扰素反应相关的免疫基因在 KO 组中下调。这些结果表明 YLPM1 可能在 GIST 的免疫调节中发挥作用。鉴于 KIT 通路在 GIST 肿瘤发生中的关键作用，他们进一步探索 YLPM1 是否调节致癌 KIT 通路。YLPM1 不调节 KIT 通路，也不调节 GIST 对 KIT 抑制剂的敏感性。他们在裸鼠中生成了 4 个异种移植模型，体内实验表明，YLPM1KO 在一定程度上促进了肿瘤生长，而 YLPM1 恢复明显减弱了肿瘤生长，尽管肿瘤含有致癌KIT突变（图3j-l）。总之，这些结果表明 YLPM1 失活促进了 GIST 增殖和生长。

为了识别 GIST 中的 CNV 标记，他们提取了 GIST 中 CNV 的拷贝数、片段大小和杂合状态的 CNV 标记，并识别了 8 个 CNV 标记，其中 COSMIC_CN1 和 COSMIC_CN9 存在于超过 50% 的 GIST 中。COSMIC_CN1 的特征是杂合片段，总拷贝数 (TCN) 为 2，大小超过 40 Mb，而 COSMIC_CN9 具有二倍体背景下染色体不稳定性的特征，在转移性 GIST 中表现出升高的水平。接下来，他们尝试使用癌症重要靶点的基因组识别 (GISTIC) 2.0 算法来分析复发的 CNV 事件。在臂级 CNV 中，22q（57%）、1p（39%）、9q（26%）、9p（23%）和 13q（20%）的缺失以及 19q（21%）和 20q（22%）的扩增更常见于转移性 GIST（图 4a）。

在局部 CNV 中，共检测到 15 个峰区域（涉及 211 个基因），缺失明显多于扩增（图 4b）。复发性缺失包括几个已知的肿瘤抑制基因（CDKN2A、DEPDC5和DMD），这些基因主要发生在高风险或转移性 GIST 中（图4b）。局部 CNV 峰中的其他癌基因包括SET和FNBP1（9q34.11 缺失），也在高风险或转移性 GIST 中富集。

由于拷贝数的增加和丢失往往伴随着基因表达的相应变化，他们进一步通过 MVisAGe 32推断了 CNV 与 mRNA 表达 (CN/GE) 之间的 Pearson 相关系数。许多在广泛和局灶区域内的基因在转移性 GIST 中表现出比在原发性 GIST 中更高的相关性（图 4c）。观察到几个众所周知的 GIST 驱动因素具有较高的 CN/GE 相关性（图 4d），例如CDKN2A、DEPDC5和SETD2。FNBP1、EP300及其周围基因均显示出适度的 CN/GE 相关性（图 4d）。

他们接下来扫描了19个GIST的WGS数据中的基因组，以寻找GIST中很少报道的两种复杂畸变：(1)染色体碎裂，其中大量断裂的片段同时发生，聚集在一条或几条染色体上，随机地将得到的碎片缝合在一起，导致2个或有时3个状态之间连续的拷贝数振荡；(2) kataegis：一种在短距离内识别的超突变模式，突变偏向单个DNA链，与重排共定位。10.5 ％ （19个中的2个）的GIST鉴定为具有染色体碎裂区域（图 5a），包括一个未接受TKI治疗的胃GIST和一个接受伊马替尼治疗的GIST。他们还在 3 个 GIST 中发现了 4 个 kataegis 事件（图 5b），其中包括 2 个肠道 GIST（1 个未接受 TKI 治疗，1 个接受 TKI 治疗）和 1 个接受伊马替尼治疗的胃 GIST。这些结果表明，GIST 中染色体碎裂和 kataegis 的发生与解剖位置无关，也与 TKI 治疗无关。在这 3 个具有 kataegis 区域的 GIST 中，69T 和 91T 在 TpC 环境中主要存在 C > T 或 C > G 突变，这是一个典型特征，可能是由 APOBEC 活性引起的。值得注意的是，所有这 5 个伴有染色体碎裂或变形的 GIST 均为侵袭性 GIST，可能表明染色体碎裂和变形事件在 GIST 进展中发生较晚。

为了了解GIST的亚克隆结构，更准确地区分早期和晚期驱动事件，他们对4例有多处病灶的转移性病例进行了克隆进化分析。病例80、84和85有4个不同部位的病灶，病例92有纵向病灶（图 6a）。这4例病例中有2例（病例84和92）未接受任何TKI治疗，而病例80接受伊马替尼治疗19个月，病例85在复发后先后接受伊马替尼和舒尼替尼长期治疗（图 6a）。每个病例的病变共有的突变较少（病例 80、84、85 和 92 分别为 36%、27%、16% 和 44%）（图 6b），而更多的突变（分别为 62%、69%、67% 和 56%）仅限于单个病变（图 6b），这意味着转移性患者的单个病变具有多克隆起源。每个病例的CNV 事件较多（病例 80、84、85 和 92 分别为 65%、94%、48% 和 51%）（图 6c）。有趣的是，他们发现病例 85 中病变间共有的突变和 CNV 比例最低（图 6b-c），而分析出的肿瘤异质性最高。

接下来，他们利用所有非沉默突变构建了这些肿瘤的系统发育树，并将共有的臂级 CNV 映射到主干上。基于此分析，他们将这些畸变分为两类：(i)主要的截短畸变，包括KIT原发突变、14q 丢失、22q 丢失、1p 丢失和YLPM1失活突变。这些畸变发生在所有主干上，很可能是启动肿瘤增殖和 GIST 早期发展所必需的；(ii)亚克隆畸变，它们占畸变的大多数，并且总是发生在分支上，表明它们对 GIST 进展过程中的肿瘤适应很重要（图 6d）。值得注意的是，经过 TKI 治疗后，对伊马替尼敏感的KIT原发突变仍然位于病例 85 的主干上，并且许多不同的KIT次要突变发生在分支上。在这些突变中，V654A和Y823D是平行进化过程中的克隆突变，而D816G，Y646C和Y823N则特异性存在于单个病灶中，反映了TKI治疗引起的肿瘤异质性（图 6d）。正如预期的那样， GIST中的KIT原发突变是基于癌细胞分数评分40的克隆性的，进一步证明了KIT作为早期驱动的作用。除KIT之外，一些发生功能性突变的癌基因也可能在分支进化中发挥作用，例如ERBB2（ R678Q），SETD2（ E119X）和KMT2C（K2797fs）（图 6d）。此外，主干和分支之间6个碱基突变的相对贡献显示出显著差异，表明不同的突变过程参与了GIST的进展（图 6e）。

他们总共鉴定了 520 个差异表达基因(DEG)，对这 520 个基因进行无监督聚类表明 4 种 mRNA 亚型（C1-C4）之间的内在异质性（图 7a）。几种驱动基因的表达水平在不同亚型之间有所不同。KIT在 C1-C3 中表达较高，在 C4 中表达最低，而PDGFRA在 C4 中表达最高。为了进一步说明差异，他们使用来自分子特征数据库 (MSigDB) 的标志性通路进行了基于排序的 GSEA，以鉴定在 4 种亚型中差异过度表达的通路。免疫相关干扰素应答相关基因（INTERFERON-ALPHA RESPONSE、INTERFERON-GAMMA RESPONSE 等）在 C1 中表达上调，细胞周期相关基因（G2M CHECKPOINT、E2F TARGETS 等）表达下调，而 C3 则恰恰相反。此外，两组代谢相关基因组 OXIDATIVE PHOSPHORYLATION 和 GLYCOLYSIS 的表达在 C2 中分别上调和下调。在 C4 中未检测到阳性富集，但与 CHOLESTEROL HOMEOSTASIS、E2F TARGETS 和 ANDROGEN RESPONSE 相关的基因表达显著下调。

免疫疗法已成为许多难以治疗的癌症的临床验证治疗方法，具有巨大的发展潜力。临床前研究报告称，伊马替尼联合免疫疗法可提高 GIST 小鼠模型中靶向药物的抗肿瘤活性，但在未经选择的 GIST 患者中，免疫疗法的疗效有限。因此，他们分析了CIBERSORT、ESTIMATE 和几个免疫治疗相关指数以确定哪种亚型可能受益于免疫治疗。CIBERSORT分析显示，浸润最多的免疫细胞为M2巨噬细胞，其次是CD4+记忆性静息T细胞和CD8T细胞，其余19种免疫细胞所占比例都很低。免疫抑制细胞（M2巨噬细胞）在C2中浸润最低，在C3中最高；相反，CD8+T细胞的富集程度在C2中最高，在C3中最低（图 7b）。免疫组化染色也证实C3中CD8+T细胞的浸润最低，这与mRNA表达分析的结果一致。此外，C3中CD4+ 记忆性静息T细胞的数量也最低（图 7b）。ESTIMATE的结果与CIBERSORT的结果一致，C3表现出最低的免疫浸润，提示C3为免疫沙漠亚型（图 7b）。此外，与其他亚型相比，C3中免疫检查点基因（PD-1和PD-L1）和免疫抑制分子的表达水平显著下调（图 7b）。这些发现支持C3具有免疫沙漠表型，不太可能从免疫治疗中获益。虽然C1、C2和C4的免疫评分没有差异，但M2巨噬细胞的比例在C2中最低，而代表免疫浸润细胞溶解活性的CYT评分和C2的CD8+ T细胞比例高于C1和C4（图 7b）。有趣的是，伊马替尼联合免疫治疗的协同作用均发生在自发性小肠GIST的KIT V559del转基因小鼠中，表明 C2（主要为小肠 GIST）最有可能受益于 TKI 联合免疫疗法。

此外，还建立了模拟分子亚型的患者来源细胞模型，以研究潜在的治疗策略。C1亚型患者在完全手术切除后甚至未接受任何 TKI 治疗也显示出良好的预后（图 7d）。GIST 原代细胞培养物(GIST-CN16)是从 C2 亚型 GIST 建立的。他们已经用 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤试验评估了 C2 亚型，进一步将 GIST-CN16 与人外周血单核细胞(PBMC)共培养，它对免疫细胞的杀伤比 C3 亚型细胞(GIST-T1)更敏感（图 7e）。在6名长期受益超过6个月的患者中，5名患者的肿瘤起源于小肠，而第6名患者的肿瘤来源不明。C3亚型频繁出现9p缺失，这影响了CDKN2A。GIST原代细胞培养物（GIST-CN2）是从C3亚型GIST（94 T，CDKN2A缺失）建立的。在这种C3衍生的GIST模型中观察到瑞普替尼（KIT抑制剂）和ibrance（CDK4/6抑制剂）的强协同作用（图 7f）。C4亚型含有PDGFRA突变。从PDGFRA D842V突变体C4 GIST建立的GIST-CN10原代细胞对avapritinib有反应，但对伊马替尼或舒尼替尼有耐药性（图 7g）。此外，avapritinib 的临床数据证实了其对由PDGFRA突变驱动的转移性 GIST 的 C4 患者有活性的证据（图7h），这代表了先前针对 PDGFRA 突变型 GIST 的药物治疗策略的验证。

结合基因组变异、表达谱、免疫特征和临床信息，他们总结了 4 种 mRNA 亚型的主要特征并提出了治疗策略的假设（图 7i）：C1（基因组稳定亚型），主要由低风险或中等风险的胃 GIST 组成，主要具有KIT外显子 11 突变，仅进行完全手术切除后预后良好（图 7d）；C2（CD8+炎性亚型），主要由高风险/转移性的肠道 GIST 组成，最终可能对 TKI 联合免疫疗法有潜在反应（图 7e）；C3（免疫沙漠亚型），几乎是高风险/转移性的 GIST，主要具有KIT外显子 11 突变，可能无法从免疫疗法中受益，但可能是使用 CDK4/6 抑制剂和 TKI 治疗的潜在候选者（图 7f）； C4（PDGFRA驱动亚型），所有PDGFRA突变的GIST，应考虑使用PDGFRA抑制剂avapritinib治疗（图 7g-h）

本项研究全面分析了 117 个 GIST 的基因组和转录组景观，其中包括来自 105 名患者的 31 个低风险、18 个中风险、29 个高风险、34 个转移性和 5 个新辅助 GIST。GIST 的肿瘤突变负担明显较低，但拷贝数变异广泛。侵袭性 GIST 的基因组畸变明显多于低/中风险 GIST。复杂的基因组改变、染色体碎裂和 kataegis 选择性地发生在侵袭性 GIST 中。虽然突变很少，但已鉴定出复发性失活YLPM1突变在高风险/转移性 GIST 中富集，功能研究进一步表明YLPM1失活促进 GIST 增殖、生长和氧化磷酸化。来自单个患者的空间和时间分离的 GIST 在转移性 GIST 中表现出复杂的肿瘤异质性。最后，提出了四种突出的亚型，它们具有不同的基因组特征、表达谱、免疫特征、临床特征和亚型特异性治疗策略。