文献解读|Cell Rep Med（11.7）：母乳微生物群与极低出生体重婴儿肠道微生物群的发育有关

母乳中含有多种细菌群落，但它们对极低出生体重（VLBW，<1500 克）婴儿微生物定植的影响仍然未知。

本项研究纳入了来自 OptiMoM 强化剂试验队列 (NCT02137473) 的 94 对母婴组合。婴儿的中位出生体重和胎龄分别为 850克和 27.4周。约 63.8% 的婴儿是通过剖腹产出生的，92.6% 的婴儿接受了抗生素治疗，中位时间为 6 天。超过一半 (59.8%) 的母亲在产前（出生前两周内）或产后接受了抗生素治疗，中位时间为 1天。 63 名（67.0%）婴儿主要以母乳喂养，而其余 31 名（33.0%）婴儿接受混合喂养并补充巴氏灭菌捐赠人乳 (PDHM)。大约一半（54.3%）的婴儿随机分配接受以人乳为基础的强化剂 (HMBF)。79 名（84.0%）婴儿在出院前放在乳房下（营养性或非营养性吸吮），并且在中位月经后年龄 34（33, 35）周开始母乳喂养。研究团队从该队列中收集的母乳和婴儿粪便样本以进行16S rRNA 基因测序。

比较母乳和婴儿粪便之间的整体 alpha 多样性时，零半径操作分类单元 (zOTU) 的数量和微生物多样性在母乳中随着时间的推移逐渐减少，但在婴儿粪便中增加 （图 1 A-B）。值得注意的是，与婴儿粪便样本相比，母乳中的 alpha 多样性更高。当分析配对的母乳-粪便样本之间的 alpha 多样性时，观察到与 zOTU 数量的非线性关系，未发现母乳和婴儿粪便中的 zOTU 数量之间存在关联，然而，当母乳样本含有 >200 zOTU，在这种情况下观察到正线性关系（图 1 C）。仅在出生后第一个月（与第二个月相比）、以母乳为主（与混合乳相比）、以母乳强化以及婴儿开始母乳喂养后才存在非线性正相关关系。未观察到配对母乳-粪便样本的微生物多样性（shannon指数）之间的关系（图 1 D）。

比较母乳和婴儿粪便样本的整体 β 多样性时，观察到不同的微生物群落结构（图 2 A）。配对母乳-粪便之间的加权 UniFrac 距离随出生后周数增加，而非加权 UniFrac 距离保持不变（图 2 B），这表明配对母乳-粪便样本中的微生物群随着时间的推移变得更加不同，并且这种差异是由细菌丰度的变化而不是特定分类群的存在或不存在所驱动。这些观察到的关系不依赖于喂养类型、强化剂类型或母乳喂养。

在母乳和婴儿粪便样本中共鉴定出 2308 个 zOTU；其中，只有 171 个 zOTU（7.4%）在配对的乳汁-粪便样本之间共存（图 3 A）。平均而言，在给定的乳汁-粪便对中共有 7 个 zOTU，并且该数量随时间推移而变化（图 3 B）。在出生后第 1 周，共有的 zOTU 占婴儿肠道中所有 zOTU 的 43.1%，到第 8 周下降到 28.7%（图 3 C）。

母乳喂养婴儿增加了共有更多 zOTU 的可能性，而出生后时期、喂养类型和强化剂类型不会改变微生物 zOTU 共有的可能性（图 3 D）。共有 zOTU映射到 60 个不同的属；12 个属在 ≥10% 的母乳-粪便对中是共存的（图 3 E），因此在后续分析中用作“常见的共有属”。这些包括未分类的肠杆菌科细菌、葡萄球菌、肠球菌、链球菌、韦荣球菌、不动杆菌、棒状杆菌、假单胞菌、嗜血杆菌、芬戈尔德杆菌和双歧杆菌。

在评估出生后时期和住院喂养实践与最常见属的 zOTU 共有之间的关系时，他们观察到，共有映射到葡萄球菌的 zOTU 随着出生后每增加一周而降低（图4）。此外，强化剂类型与共有zOTU映射到链球菌的可能性增加相关，因此从HMBF喂养（与以母乳为强化剂[BMBF]喂养）的婴儿收集的成对母乳-粪便中共有zOTU的可能性更大。母乳喂养婴儿也增加了与韦荣球菌、链球菌和嗜血杆菌共有zOTU图谱的可能性。同样，当他们进行层次聚类分析以确定zOTU共有模式时，一旦婴儿开始接受母乳喂养，他们更有可能出现以韦荣球菌属、链球菌属、嗜血杆菌属和梭状芽胞杆菌属等数个属为特征的zOTU共有模式。

接下来，他们研究了母乳中细菌属的剂量与婴儿肠道中的浓度之间是否存在线性关系。对于这些分析，他们仅纳入了母乳和婴儿粪便样本中都存在的母乳-粪便对。从临床角度而言，这旨在识别具有剂量反应关系的潜在属，可作为未来研究和临床应用的靶标。每对粪便前 3 天的累积细菌摄入量与婴儿粪便中的总细菌浓度呈正相关（图 5B）。在所检测的 12 个属中，有 7 个属，3 天从母乳中摄入的细菌与随后婴儿粪便中的细菌浓度呈正相关（图 5 A）；这些正相关性在韦荣球菌、梭状芽胞杆菌和假单胞菌中表现最强。Finegoldia的 3 天摄入量与其在婴儿粪便中的浓度呈负相关，而葡萄球菌、棒状杆菌、嗜血杆菌或双歧杆菌的 3 天摄入量与其在婴儿粪便中的浓度无相关性。

然后，他们检测了出生后和住院喂养方式是否会改变婴儿 3 天母乳细菌摄入量与粪便中细菌浓度之间的关系（图 5C-D）。在出生后 1 个月（与 2 个月相比），3 天的母乳摄入量与婴儿粪便中总细菌浓度和未分类的肠杆菌科浓度之间呈现出更强的正相关关系。相反，在产后第二个月，观察到3天母乳摄入量与婴儿粪便中假单胞菌浓度之间存在正相关关系。主要以母乳喂养的婴儿（与混合喂养和 PDHM 相比）的 3 天细菌摄入量与粪便中总细菌浓度和未分类的肠杆菌科细菌浓度之间呈现出更强的正相关关系。强化剂类型还改变了 3 天母乳细菌摄入量与婴儿粪便中细菌浓度之间的关系，3 天母乳中肠球菌的摄入量与婴儿粪便中细菌浓度呈正相关，但仅限于 BMBF 喂养的婴儿。最后，在开始直接母乳喂养之前，3 天母乳中梭状芽胞杆菌和韦荣球菌的摄入量与婴儿粪便中细菌浓度呈正相关；然而，一旦婴儿开始母乳喂养，这些关系就不再存在。

为了研究母乳中不同细菌属（摄入量）与婴儿肠道中各属的浓度之间的复杂关系，他们评估了母乳和婴儿粪便中 12 种最常见的细菌属之间的相关性。144 个潜在相关性中有 45 个具有统计学意义，显示出不同的相关性强度（图 6 A）。除棒状杆菌、梭状芽胞杆菌、嗜血杆菌和双歧杆菌外，特定细菌属的 3 天摄入量与配对婴儿粪便样本中同属的浓度呈正相关（图 6 B）。不动杆菌、未分类的肠杆菌和假单胞菌的摄入量聚类为正相关矩阵，因此母乳中任何这些属的摄入量越高，其粪便浓度就越呈正相关。重要的是，婴儿粪便中这 3 个属的浓度与其他细菌属的母乳摄入量越高呈负相关，包括韦荣球菌、双歧杆菌和肠球菌。

为了确定这些相关性是否取决于出生后时期，他们构建了分层相关矩阵（图 6 C）。例如，在 1 个月的样本中，许多与早产儿肠道微生物成熟度相关的属（如双歧杆菌、链球菌和韦荣球菌）在母乳摄入量和粪便浓度之间呈正相关（例如，从母乳中摄入的韦荣球菌与婴儿粪便中的双歧杆菌浓度呈正相关）。相反，在第 2 个月期间这些“微生物成熟度”分类群之间的正相关性较少，但它们从母乳中的摄入量与粪便中伽马变形菌（如假单胞菌和不动杆菌）的浓度呈负相关，而伽马变形菌与早产儿疾病有关（例如，从母乳中摄入的链球菌与婴儿粪便中的假单胞菌浓度呈负相关）。

为了检测母亲或婴儿的抗生素暴露是否改变了母乳中微生物群和 VLBW 婴儿肠道之间的关系，他们将母婴二元组分为 4 个抗生素组（母亲高-婴儿高、母亲高-婴儿低、母亲低-婴儿高和母亲低-婴儿低）。高抗生素暴露定义为母亲（产前或产后）> 1 天和婴儿> 3 天。选择这些截止值是为了区分针对该人群的常规预防性抗生素给药（例如，在剖宫产期间给母亲服用或给 VLBW 婴儿服用以降低早发性脓毒症风险）和用于治疗疑似或确诊感染的抗生素用量。母亲及其婴儿的抗生素暴露改变了母乳-粪便配对的 alpha 多样性的关系（图 7 A-B）。

具体而言，仅在抗生素暴露水平较低的母婴二元组中（母亲低-婴儿低组），母乳和婴儿粪便中的 zOTU 数量与 Shannon 指数之间存在正相关。母乳中 12 种最常见细菌属的 3 天摄入量与婴儿粪便中浓度之间的相关性也因抗生素组而改变。与“微生物成熟度”分类群和伽马变形菌门的类似正相关性和负相关性，与其他抗生素治疗组相比，母亲低-婴儿低组的相关性最强。

本项研究分析了早产母乳中的微生物群落与 VLBW 婴儿肠道在初次住院期间的关系。母乳-粪便对之间共有的zOTU 占 VLBW 婴儿肠道中 zOTU 的 30%-40%。从母乳中摄入的几种菌属与它们在婴儿肠道中的浓度之间存在剂量反应关系，这些关系会随时间而变化，并会受到住院喂养方式（尤其是直接母乳喂养）和母婴抗生素使用的影响。母乳和粪便微生物群落之间也存在相关性，这表明多种母乳微生物可能共同影响整个肠道群落。这些结果表明，母乳微生物群可能通过传递特定的细菌和复杂的微生物相互作用来塑造极低出生体重婴儿的肠道定植。