文献解读|Nat Commun（16.6）：TRIM40通过破坏肠道屏障完整性驱动炎症性肠病的发生

肠道上皮的完整能够防止肠道微生物群或有害外源性因素易位，从而维持免疫稳态，破坏肠道保护屏障会导致 炎症性肠病(IBD)的发作和进展。尽管IBD的主要特征是与炎症相关的特定基因表达模式、组织完整性、细胞粘附和屏障功能的改变，而这些变化是IBD的致病因素还是发病结果尚不清楚。此外，这些变化的分子机制及它们引发IBD发展阶段尚待阐明。肌动蛋白细胞骨架在维持肠道屏障完整性方面起着关键作用，由细胞骨架结构扰动诱导的上皮功能障碍导致紧密连接或粘附连接（AJ）的丧失能够增加肠道通透性。Rho相关含线圈的蛋白激酶1（ROCK1）是肌动蛋白聚合和稳定的必需激酶，在肌动蛋白动力学和细胞迁移中起着重要作用。然而目前的研究对ROCK1的表达或稳定性调节的具体机制知之甚少。在这里，作者将TRIM40确定为IBD的致病驱动因素，其直接靶向ROCK1进行降解，导致肌动蛋白细胞骨架稳定所需的下游信号转导事件的破坏，导致上皮屏障功能衰竭，并最终导致IBD的发展。这项研究提供了概念证明，TRIM40的表达是肠道慢性炎症的主要病理驱动因素，因此可能是限制IBD起始和发展的潜在生物标志物或治疗靶点。

为了确定驱动IBD潜在致病因素，作者访问了IBD患者直肠活检样本的公共基因表达数据集，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者。通过评估与诱导IBD相关的特征基因（包括与细胞因子、补体系统、组织完整性、屏障功能和抗菌肽相关的基因），发现 UC 和 CD 患者中 TRIM40 和 TRIM69 的基因表达水平相对于健康对照组显著增加（图1A）。与TRIM69 不同，TRIM40 的基因表达在大多数人体组织和人源性细胞系中几乎检测不到，包括结肠上皮细胞（HT-29、HCT116 和 Caco-2），这与TRIM31在肠道中高表达形成鲜明对比（图1B）；此外，TRIM40在IBD样品中的表达远高于非IBD健康人肠道组织（图1B）。作者分析了来自IBD患者直肠和回肠区域的另外三个转录组测序（RNA-seq）数据集，结果表明，UC和CD患者直肠样本中的TRIM40显著增加，但在回肠组织中没有（图1C）。在UC患者的直肠粘膜（疾病特别受累部位）中也观察到异常的TRIM40过表达（图1D）。使用来自UC和CD患者炎症区域的直肠活检标本证实了这一现象（图1E）。

为了评估IBD患者的TRIM40蛋白的表达水平是否升高，我们使用人TRIM40特异性抗体进行了免疫组织化学染色，与非IBD的对照组不同，TRIM40蛋白在UC和CD的结肠组织中显著着色（图1F）。作者在人结肠上皮细胞系HT-29中进行RNA-seq和微阵列分析来探索TRIM40过表达对RNA转录本全局特性的影响，HT-29稳定地过表达N末端Myc标记的TRIM40（Myc-TRIM40）。值得注意的是，TRIM40过表达的HT-29细胞的转录组图谱显示出IBD特征基因的实质性变化，包括细胞骨架相关的基因和干扰素刺激基因（ISG），这一结果也通过定量PCR（qPCR）测定得到证实（图1G，H）。TRIM40主要在细胞质中表现出丝状图案，在细胞核内检测到微弱的信号， GFP标记的TRIM40（GFP-TRIM40）的过表达与异常形态变化相吻合，包括细胞间排斥，相邻细胞之间的显着间隙，以及最终的扩散（图1I 右）；在形成紧密簇的对照HT-29细胞中未观察到这些形态变化（图1I 左）。TRIM40过表达的HT-29细胞之间的平均边距也明显大于对照组HT-29细胞（图1J)。这些结果表明，表观遗传沉默的TRIM40的高表达可能作为潜在的内在线索，导致结肠上皮细胞细胞骨架结构的扰动。

图1:上调的TRIM40通过改变细胞形态和骨架促进IBD 发生。

(A) 维恩图说明了UC和CD患者以及健康对照组之间重叠的差异表达基因。(B) 基因型-组织表达项目中IBD(GSE117993)RNA-seq数据与正常组织TRIM40或TRIM69表达的对比分析。(C)、(D) UC、CD和正常样本(GSE109142、GSE117993和GSE57945）在直肠和回肠(C)或直肠粘膜(D)中TRIM40表达的比较。(E) qPCR实验比较IBD患者与正常组织TRIM40 mRNA水平。(F) IHC 分析对照组、UC或CD 患者TRIM40的表达。(G) 热图显示了RNA-seq的指示基因在对照载体或表达Myc-TRIM40的HT-29细胞中的相对表达。(H) qPCR显示对照载体或表达 Myc-TRIM40的HT-29细胞中指示基因的相对mRNA水平。(I)，(J) 显微分析显示对照组或表达GFP-TRIM40的HT-29细胞的形态改变。

由于肌动蛋白细胞骨架是调节细胞间粘附的核心，作者进一步探讨了TRIM40表达对肌动蛋白动力学的影响。对照组HT-29细胞有与质膜结合的薄肌动蛋白网络层，显示出组织良好的皮质结构（图2A）；然而，过表达TRIM40的细胞表现出皮质F-肌动蛋白的回缩和碎裂，以及F-肌动蛋白在细胞内接触位点的不规则积累和部分TRIM40的丝状拉伸（图2A）。预粘附连接（AJ）通常被观察到为与细胞-细胞接触区域对齐的点状结构，通过促进AJ组分募集到AJ区域来驱动相邻细胞之间的膜闭合，形成细胞-细胞粘附拉链。值得注意的是，尽管细胞间边界存在F-肌动蛋白点，但TRIM40过表达细胞未能形成粘附拉链（图2A）。这些细胞特异性地含有主要AJ成分（CD44和E-钙粘蛋白）的不连续簇，它们位于表面膜或细胞间区域，而不是被募集到AJ区域（图2B）。作者观察到大多数（>80~90%）的黏着蛋白位于局灶性粘连附近，在正常条件下，少数细胞在细胞-细胞接触区域显示黏着蛋白染色。然而，在表达TRIM40的细胞在细胞-细胞接触位点甚至无法检测到黏着蛋白的微弱荧光信号（图2B）。AJ成分的这种分布和相邻细胞之间交叉的丧失与对照组细胞不同，对照细胞的特征是沿着绝大多数侧细胞边界的密集，连续的AJ区域，没有空隙（图2B）。为了验证TRIM40有助于F-肌动蛋白破坏的可能性，从对照和TRIM40过表达细胞中分离出富集的G-和F-肌动蛋白部分。与对照细胞相比，TRIM40过表达细胞中可溶性G-肌动蛋白的量显著增加;值得注意的是，F-肌动蛋白减少了类似的量（图2C）。

作者设计了一个用于多西环素诱导的TRIM40表达的Tet-On系统，能够以受控的方式过表达TRIM40，并准确监测TRIM40在上皮细胞中过表达的具体影响。在多西环素处理后，HT-29细胞中的p-ERM水平显著下降（图2D，E），而TRIM40的表达最大化。此外，在过表达TRIM40的细胞中，上皮膜完整性也被破坏，如测量所示，上皮细胞中的电阻抑制为>80%（图2F）。作者的研究结果表明，表观遗传抑制的TRIM40的过度表达会导致病理功能的增加，这与一系列影响上皮细胞完整性的分子过程有关，包括ERM磷酸化、潜在的皮质F-肌动蛋白形成和稳定。

图2：TRIM40 通过破坏皮质肌动蛋白细胞骨架的稳定来破坏上皮完整性。

(A)、(B) 对照组细胞与表达Myc-TRIM29载体的HT-40细胞的共聚焦荧光图像。(C) 免疫印迹显示对照组细胞与表达Myc-TRIM29载体的HT-40细胞的可溶性(S)和不溶性(I)组分中的β-肌动蛋白水平。(D) 免疫印迹显示，使用多西环素诱导系统暂时过表达GFP-TRIM29的HT-40细胞中p-ERM水平降低。(E) 多西环素诱导的GFP-TRIM40过表达细胞中GFP-TRIM40 (绿色)和磷酸化ERM (p-ERM，红色)的共聚焦荧光图像。(F) 检测经多西环素处理的过表达GFP-TRIM40的Caco-2细胞的跨上皮电阻(TEER)值。

Rho家族的GTPases-Rac1、Cdc42和RhoA是最常见的分子开关，能够激活两种主要的激酶PAK和ROCK1（图3A）。PAK和ROCK1的激活触发下游关键效应蛋白LIMK1、MLC2和ERM的磷酸化，最终促进F-肌动蛋白和皮质肌动蛋白的形成和稳定（图3A）。在TRIM40过表达HT-40的TRIM29上皮细胞中，ROCK1蛋白水平显著降低，但mRNA水平没有降低（图3B）；然而并未在ROCK1的上游或下游蛋白质RhoA，LIMK1，MLC2，cofilin1（CFL1）和profilin1（PFL1）观察到类似的结果（图3B）。TRIM40过表达阻断了LIMK1和MLC2的磷酸化，它们是ROCK1的已知底物，此外还观察到对ERM磷酸化的抑制作用（图3B）。最终，抑制LIMK1磷酸化导致CFL1磷酸化的破坏（图3B）。使用正常的结肠上皮细胞系FHC证实了这一点，表明TRIM40过表达明显降解ROCK1，随后破坏FHC细胞中的CFL1磷酸化（图3C）。由于TRIM40具有RBCC泛素连接酶结构域，作者推测TRIM40直接靶向ROCK1进行降解。

值得注意的是， MG132蛋白酶体抑制剂阻止了TRIM40介导的ROCK1蛋白水平降低，而溶酶体抑制剂氯喹没有效果（图3D）。此外，在MG132处理后，表达TRIM40的细胞显示出TRIM40与ROCK1的相互作用以及ROCK1泛素偶联物的大量积累（图3E，F）。

图3：TRIM40通过促进ROCK1降解来调节RhoA–ROCK1信号转导。

(A) Rho家族GTP酶的肌动蛋白细胞骨架信号通路示意图。(B) 免疫印迹实验检测表达对照载体或Myc-TRIM40的HT-29细胞中与肌动蛋白细胞骨架相关的信号蛋白的表达。(C) 免疫印迹分析检测表达对照载体或Myc-TRIM40的FHC细胞中ROCK1、p-CFL1和CFL1的蛋白水平。(D) 用MG132（29μM）或氯喹（CQ，40μM）处理1小时后，免疫印迹分析检测表达对照载体或Myc-TRIM40的HT-29细胞中ROCK1的蛋白水平。(E) 在表达对照载体或Myc-TRIM40的HT-29细胞中对TRIM40和ROCK1进行免疫共沉淀。(F) 免疫印迹实验检测表达对照载体或Myc-TRIM40的HT-29细胞中ROCK1泛素化水平。

为了进一步确定TRIM40 哪个功能结构域负责降解ROCK1，作者构建了TRIM40ΔRING、TRIM40ΔBB、TRIM40ΔCC或TRIM40ΔCT的 TRIM40 突变体（图4A)。TRIM40ΔRING未能诱导ROCK1泛素化（图4B），导致ROCK1蛋白水平部分恢复（图4C）。通过E3连接酶死亡的TRIM40突变体（TRIM40-C29S）也间接证明TRIM40ΔRING失去功能活性，导致TRIM40未能降解ROCK1（图4D）。共聚焦分析还显示，在表达TRIM40-C29S的细胞中，皮质肌动蛋白也出现了类似的部分恢复，正如在TRIM40ΔRING的细胞中观察到的那样（图4E）。这一发现表明，TRIM40的E3连接酶活性对于引导ROCK1通过泛素-蛋白酶体途径进行降解是必要的。此外，TRIM40ΔBB完全失去了对ROCK1的结合亲和力（图4F），导致TRIM40未能驱动ROCK1降解和皮质肌动蛋白破坏（图4C，E）。TRIM40ΔCT的二聚体形式的产生使作者推测C末端区域在结构上阻止了TRIM40二聚化（图4C，F），这可能是影响其破坏上皮完整性能力的决定性因素。事实上，TRIM40ΔCT对ROCK1降解或相互作用没有影响（图4C，F），并最终失去了其皮质肌动蛋白破坏功能（图4E）。此外，TRIM40ΔBB和TRIM40ΔCT均未使细胞间距离缩小，并且TRIM40ΔRING仅部分影响了细胞间的距离（图4G），表明TRIM40突变体影响ROCK1降解的功能能力直接反映在皮质肌动蛋白形成和细胞间距离中。综上所述，这些结果表明，TRIM40通过RBCC结构域与ROCK1相互作用，作为E3连接酶直接靶向ROCK1，并且促进ROCK1的降解从而导致上皮细胞完整性的破坏。

图4：TRIM40的RING结构域、B box结构域和C端结构域是降解ROCK1所必需的结构。

(A) 全长TRIM40（WT）和TRIM40突变体的结构示意图。(B) 免疫印迹显示表达对照载体、WT-TRIM40或TRIM40∆RING细胞中ROCK1的泛素化水平。(C) 免疫印迹实验检测表达WT-TRIM40或TRIM40突变体的HT-29细胞中ROCK1的蛋白水平。(D) 免疫印迹检测表达对照载体WT-TRIM40或TRIM40-C29S的HT-29细胞中ROCK1的蛋白水平。(E) 共聚焦图像显示表达对照载体、WT-TRIM40、TRIM40缺失或TRIM40-C29S的HT-29细胞中皮质F-肌动蛋白的水平。(F) 在表达对照载体、WT-TRIM40或TRIM40缺失突变体的HT-29细胞中对TRIM40突变体和ROCK1进行免疫共沉淀。(G) 关于表达对照载体、WT-TRIM40、TRIM40∆RING、TRIM40∆BB box和TRIM40∆CT的HT-29细胞间距离的统计分析。(H) TEER实验检测表达对照载体WT-TRIM40或TRIM40缺失突变体的Caco-2细胞的肠上皮屏障功能。

研究结果表明，经DSS诱导的小鼠结肠组织Trim40表达显著增加（5A）。为了进一步证实这一点，作者通过特异性识别小鼠Trim40 mRNA的RNA探针进行RNA原位杂交测定，观察到DSS处理的小鼠直肠和结肠组织中Trim40表达显著增加（图5B）。作者构建了Trim40−/−小鼠，在DSS诱导之后，Trim40−/−小鼠出现UC的临床症状，如体重减轻和结肠长度缩短，但这些症状并没有对照小鼠严重（图5D）。尽管Trim40 −/−小鼠体重有所下降，但在DSS去除后逐渐恢复，并未在对照小鼠中观察到类似情况（图5C）。由于UC症状严重，大多数对照小鼠在DSS给药后10天内死亡，而约70%的Trim40−/−小鼠存活期超过2周（图5E）。组织病理学还证实，在DSS诱导后，Trim40−/−的小鼠肠道上皮屏障、隐窝和杯状细胞结构保持完整，固有层或上皮中未观察到可见的淋巴细胞浸润（图5F）；相比之下，对照小鼠表现出严重的上皮屏障破坏，杯状细胞较少，隐窝变形，在直肠和远端结肠中都清楚地观察到淋巴细胞的广泛浸润（图5F）；此外，DSS能够诱导小鼠体内的促炎细胞因子和趋化因子表达，与对照组相比，Trim40−/−小鼠产生的细胞因子显著减低，除外抗炎细胞因子IL-10（图5G）。与人上皮细胞的体外结果一致，DSS处理的对照小鼠由于TRIM40上调ROCK1（mROCK1）蛋白水平显著降低；然而，无论DSS给药如何，在Trim40−/−小鼠中未观察到mROCK1表达水平的降低（图5H）。总的来说，体外和体内结果表明，TRIM40促进ROCK1降解和随后的F-肌动蛋白不稳定，导致肠上皮屏障功能的丧失。

图5：缺乏Trim40的小鼠不易发生DSS诱导的结肠炎。

(A) qPCR检测2% DSS 诱导的结肠炎中小鼠结肠组织Trim40的mRNA水平。(B) ISH显示2% DSS给药后的WT 雄性小鼠直肠或远端结肠组织中的Trim40 mRNA水平。(C) 在3.5% DSS给药后检测WT和Trim40−/−的雄性小鼠体重减轻情况。(D) 雄性小鼠在2%DSS给药后第7天的结肠长度图像。(E) 用3.5% DSS处理8天，然后用正常水处理7天的雄性小鼠的存活曲线。(F) 在3% DSS后第1天对WT和Trim40−/−的雄性小鼠的直肠E-钙粘蛋白进行H&E染色和IHC染色。(G) qPCR检测2%DSS诱导的结肠炎中小鼠结肠组织相关基因的mRNA水平。(H) 免疫印迹实验检测2.5%DSS持续3天给药后的WT和Trim40−/−的雄性小鼠直肠区域的ROCK1蛋白水平。

1、健康状态下，TRIM40并不表达从而维持ROCK1的正常表达，ROCK1磷酸化LIMK1，从而使CFL失活，进而维持肠道上皮的完整性。

2、IBD发生时，表观遗传沉默的 TRIM40的表达上调，直接靶向ROCK1降解和皮质肌动蛋白破坏，加速破坏上皮完整性和功能，最终导致严重的肠道组织损伤。

3、TRIM40可能代表一种潜在的生物标志物，用于使用直肠组织活检诊断UC和CD以及限制IBD发生和发展的治疗靶点。

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