文献解读|BMC Genomics（4.547）：转录组m6A表达谱分析揭示猪精子冷冻保存过程中mRNA转录后修饰

首先，使用RT-qPCR和蛋白质印迹（WB）检测Fs和Fts组中负责m6A修饰的五种主要酶的表达，包括METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和YTHDF2。在Fts组中，METTL3、METTL14、ALKBH5和YTHDF2的mRNA表达水平显著降低，而FTO显著升高（图1A）。METTL3、METTL14和FTO的蛋白水平在Fts组显著下调，而ALKBH5和YTHDF2在Fts组中显著上调（图1B和1C）。这表明，冷冻保存可以调节负责m6A修饰的主要酶的表达变化，进而诱导m6A甲基化修饰发生变化。

图1. 猪新鲜、冷冻精子m6A修饰酶的表达情况

通过MeRIP-Seq，从所有样本文库中获得超过78000000个clean reads，参考基因组比对结果表明map ratio超过75.09%。在Fs和Fts中分别鉴定到3647和4033个m6A 峰（peaks），其中1048个peaks为FS和Fts所共有（图2A）。与Fs相比，在Fts组中的1442个mRNA中鉴定到1613个显著上调的peaks，在312个mRNA中鉴定到315个显著下调的peaks（图2B）。

为了确定所有peaks中存在保守的RRACH序列（R = 嘌呤，A= m6A，H =非鸟嘌呤碱基），对所有精子样品的前2000个m6A峰进行富集分析，得到了5个共有序列，它们都符合RRACH序列特征，表明测序数据是可靠的（图2C）。此外，在Fs和Fts组中，m6A峰在基因元件上集中分布于编码区（CDS）、起始密码子和终止密码子附近；Fts在CDS中的m6A峰富集比例高于Fs（53.2% vs 44.3%, 图2D和2E）。在Fs和Fts中，大约70%~80%的基因仅有1个m6A峰，而Fts中含有2个或更多m6A峰的转录本数量比Fs多（图2F）。

图2. Fs和Fts的m6A甲基化谱

将所有差异m6A甲基化位点（DMMS）定位到染色体上，以评估其分布特征（图3A）。DMMS相对密度最高的前5条染色体为12、3、14、2和7号（图3B）。使用IGV软件，从MeRIP-Seq结果中选择SORD（高甲基化峰）和NAGK（低甲基化峰）两个代表性的DMMS进行可视化展示（图3C）。进一步，随机选择10个具备DMMS的基因，使用MeRIP-qPCR检测它们的总m6A水平。研究表明，6个高甲基化基因FOXO 3、NADK 2、ACLY、HIF 1A、SLC9A3R1和PKM，以及1个低甲基化基因FASN参与精子质量的调节。通过MeRIP-qPCR测定， 9个基因的m6A水平变化与MeRIP-Seq数据一致（图3D）。这进一步表明测序数据的准确性。

图3. 差异m6A甲基化位点（DMMS）的分布及MeRIP-qPCR验证

为了探究mRNA上m6A甲基化修饰在冷冻精子中的生物功能，对差异m6A甲基化基因（DMMGs）进行GO和KEGG通路分析。GO分析（生物过程，BP；细胞成分，CC；分子功能，MF）发现，Fts中的高甲基化基因显著富集到代谢过程，包括大分子代谢和有机物代谢过程、基因表达和转录。此外，这些基因还在细胞和细胞内细胞器、蛋白质结合（图4A）中发挥作用。Fts中的低甲基化基因显著富集在RNA聚合酶II启动子的转录、RNA代谢过程的调节、转录调节和DNA模板、外侧质膜，以及转录调控区DNA结合、酶结合（图4B）等。此外，KEGG通路分析显示，DMMGs显著富集在mTOR、AMPK、MAPK和TGF-β信号通路（图4C、4D）。

图4. 差异m6A甲基化基因 (DMMGs)的GO和KEGG分析

考虑到m6A修饰在调节基因表达中的重要功能，通过RNA-Seq分析新鲜、冷冻精子的转录组变化，评估m6A甲基化对冷冻精子转录水平的影响。差异分析表明，和新鲜精子相比，冷冻精子共有295个基因显著上调，2071个基因显著下调（图5A）。DMMGs和DEGs的联合分析共鉴定了13个高甲基化-上调基因（hyper-up）、19个低甲基化-下调基因（hypo-down）、149个高甲基化-下调基因（hyper-down）以及3个低甲基化-上调基因（hypo-up）（图5 B）。GO和KEGG分析显示，差异m6A甲基化的DEGs涉及精子获能、钙介导的信号传导、精子活力和细胞凋亡等生物学过程（图5C、5D）。表1列出了Fs和Fts之间的9种差异m6A甲基化的DEGs，这些DEGs与精子质量和功能相关，包括精子活力和获能的调节。

图5. DMMGs和差异表达基因（DEGs）的联合分析

表1 差异m6A甲基化的DEGs的功能