文献解读|Cancer Cell（50.3）祖细胞样耗竭 SPRY1 + CD8 + T 细胞增强食管鳞状细胞癌对新辅助 PD-1 阻断的反应

食管癌是全球第七大癌症相关死亡原因，其中食管鳞状细胞癌(ESCC) 约占所有病例的 90%。新辅助免疫检查点阻断(NICB)在可手术的ESCC中显示出巨大应用前景，但缺乏可用的有效生物标志物。

为了表征 NICB 反应性ESCC的肿瘤免疫特性，研究者团队从 II 期临床试验中收集了可手术的局部晚期 ESCC 患者的肿瘤标本（图1A）。在内窥镜检查和手术期间（治疗后）治疗前（治疗前）收集肿瘤组织，他们利用单细胞转录组数据(scRNA-seq)分析了来自 7 名患者（发现队列）的 14 个配对治疗前和治疗后肿瘤样本，以创建用于分析的细胞图谱。在NICB疗效评价中，病理评估食管及转移淋巴结内无残留肿瘤细胞定义为完全消退/缓解 (CR) ，部分或较差的消退/缓解定义为非完全消退/缓解(NCR)（图1B）。他们获得了111262 个细胞的scRNA图谱，并鉴定了患者、治疗和反应中共享的免疫和非免疫细胞聚类（图 1 C-D）。NICB治疗后，CR组病灶外观发生巨大变化，从典型的肿瘤特征（治疗前）到几乎完全恢复正常黏膜外观（治疗后）（图1B），表明NICB可能促进TME的细胞重塑。他们使用主成分分析(PCA)来检测TME内细胞组成的变化。在CR组中，NICB前后，可见类似于癌症向正常食管细胞转变的模式（图1E），反映了达到CR的患者成功的抗肿瘤反应。这些结果提示ICB在食管鳞癌中在单细胞水平上具有微环境重塑作用。

在有反应者之间所有细胞类型的细胞比例差异最大的是T细胞。PD-1的表达仅限于T细胞，治疗前后CR组的PD-1表达均高于NCR组（图1F）。值得注意的是，与NCR患者相比，CR患者在肿瘤中表现出更高的T细胞浸润（图1G），这表明 CD8+ T 细胞在 ESCC 的 NICB 中发挥着关键作用。

图1. 免疫治疗前后食管鳞癌的细胞概述。

(A) 研究概述。(B) NICB 前后 CR 和 NCR 肿瘤的代表性图像。 (C) UMAP 可视化（上）捕获的所有细胞，按主要细胞类型、患者、治疗和反应着色，饼图显示每组细胞类型的百分比（下）。(D) UMAP 显示所有细胞子集。(E)细胞聚类动态变化的主成分分析。(F) 标准化PD-1表达的热图和针对PD-1表达进行着色的 UMAP 。(G)所有 CD45 +细胞中 CD8 +和 CD4 + T 细胞的分数。

当使用基于图的聚类算法将T细胞进行亚聚类分析时，他们检测到两个CD8+ T细胞聚类和一个CD4+ T细胞聚类，它们高表达标志T细胞耗竭的PDCD1、HAVCR2和LAG3（图2A）。他们还鉴定了几个典型的T细胞群，包括调节性(Treg)，中央记忆(Tcm)，效应性记忆(Tem)和组织驻留记忆(Trm)T细胞亚群。他们首先研究了抗PD-1对耗竭T细胞(Tex)的调节。在NICB后，Tex的耗竭特征活性显著降低，并且这种降低在CD8+ Tex中比CD4+ Tex中更明显（图2B）。他们还观察到，在Tex治疗后，T细胞介导的抗肿瘤反应活性显著提高，证明NICB激活食管鳞癌TME内的Tex。

接下来，他们将重点放在CD8+ Tex上，因为最近的研究发现了不同的CD8+ Tex亚群具有不同的功能状态，包括末端CD8+ Tex和祖/前体CD8+ Tex (Tpex)，它们优先对免疫检查点阻断(ICB)反应。

他们确定了两个不同的转录异质性 CD8 + Tex 细胞聚类（图 2C），其中一个细胞聚类（“CD8 + Tex-SPRY1”）专门表达高水平的SPRY1，另一个细胞聚类（“CD8 + Tex-XAF1”）高表达几种干扰素刺激基因（XAF1、IFI44L和MX1）。

为了研究ESCC中发现的CD8+ Tex聚类是否表现出Tpex表型，他们对单个细胞的祖细胞和终末细胞CD8+ Tex基因特征进行了评分。通过比较ESCC中CD8+ Tex-SPRY1聚类和CD8+ Tex-XAF1聚类的转录特征评分，他们发现ESCC中CD8+ Tex-SPRY1聚类与表达TCF7的Tpex具有显著更高的转录相似性（图2D）。

所有 CD8+Tex 细胞的 RNA 速度和伪时间推断分析表明，CD8 + Tex-SPRY1 聚类在伪时间中排序较早，而 CD8+ Tex-XAF1 聚类偏向较晚的伪时间值。这些结果表明 CD8+ Tex-SPRY1 细胞更有可能是早期衰竭细胞（图 2 E）。

为了进一步验证在伪时间的早期和晚期，CD8+ Tex细胞具有更多的祖细胞和终末耗竭表型这一假设，他们研究了祖细胞和终末CD8+ Tex标记的表达在伪时间轨迹上的动态变化。CD8+  Tex细胞的祖细胞耗尽信号的表达随着伪时间的推移而减少，而终端耗尽信号则随着伪时间的推移而增加（图2F）。然后，他们沿着动态生物学伪时间可视化标记基因和功能基因的表达（图2G）；抑制检查点（TIM-3、LAG3和PD-1）的表达也随着伪时间的推移而显著增加。与肿瘤特异性CD8+ T细胞和终末耗竭相关的ENTPD1在伪时间后期表达增加。与更多祖细胞状态相关的TBX21和REL的表达水平均在轨迹早期增加，但在伪时间后期降低。相比之下，TOX和EOMES的表达在整个伪时间内逐渐增加，而这两种基因与更接近终末耗竭的表型。CD8+ Tex-SPRY1细胞聚类主要在伪时间中排序较早，表明CD8+ Tex-SPRY1细胞具有更“明显的祖细胞”活性和“早期耗竭”阶段。总的来说，这些数据证明了ESCC中CD8+ Tex-SPRY1细胞的祖细胞样表型。

图2. 祖细胞样 CD8 + Tex 细胞的鉴定。

(A) T 细胞的亚聚类，按亚型着色和标记。(B) Tex 聚类中耗竭的 T 细胞特征和 T 细胞介导的对肿瘤特征的免疫反应的富集。(C) CD8 + T 细胞聚类中选定标记基因的表达。(D) 箱线图显示了 CD8+ Tex 聚类的祖细胞与终末耗尽 CD8+ T 细胞的基因特征评分的比率。(E) CD8 + Tex 聚类的 RNA 速度分析。(F) 散点图显示祖细胞（左）和终末细胞（右）沿伪时间的耗尽特征的表达。(G) CD8 + Tex 细胞轨迹中选定基因沿伪时间的表达模式。(H) CR 和 NCR 肿瘤之间CD8 + Tex-SPRY1 细胞的频率。(I) 散点图显示治疗前 CD8 + Tex-SPRY1 细胞浸润与 NICB 治疗期间肿瘤 SUVmax 降低之间的显著相关性。(J) 肿瘤反应与不同 T 细胞子集细胞比例的排名相关性。

接下来，他们研究了CD8+ Tex-SPRY1细胞与NICB结果之间的关系，发现治疗前CR肿瘤中CD8+ Tex-SPRY1细胞的比例高于NCR肿瘤（图2H）。重要的是，在分析治疗前NICB诱导的肿瘤反应时， CD8+ Tex-SPRY1细胞浸润与肿瘤反应显著相关（图2I-J），表明 ESCC 中的 CD8+ Tex-SPRY1 细胞是免疫治疗的潜在生物标志物。

为了进一步研究 CD8+ Tex-SPRY1 细胞对免疫治疗的预测价值，他们纳入了额外的 ESCC NICB 队列和治疗前肿瘤样本，以进行多重免疫组化(IHC)[验证队列 1 (VC1)]和bulk 转录组分析(bulk RNA-seq)[验证队列 2 (VC2)]（图 3 A）。CR的患者在肿瘤区域和肿瘤周围的间质区域有显著较高的SPRY1+CD8+PD-1+共表达细胞密度（图3B-C）。相反，NCR组CD8+PD-1+细胞上SPRY1的共表达水平较低。接下来，在VC2的bulk RNA-seq数据中，他们根据CD8+ Tex-SPRY1的标记基因（CD8、PDCD1和SPRY1）表达水平确定了CD8+ Tex-SPRY1细胞浸润的特征。与NCR组相比，在CR组观察到CD8+ Tex-SPRY1特征评分水平显著较高（图3D），且与更好的无病生存相关（图3E）。此外，与PD-L1相比，CD8 +Tex-SPRY1细胞在预测CR方面具有更高的价值（图3F）。进一步的亚组分析显示，无论PD-L1状态如何，CR组比NCR组CD8+ Tex-SPRY1特征表达更高（图3G）。针对其他临床特征（包括TNM分期和PD-L1）进行校正后，多变量Cox回归显示，CD8+ Tex-SPRY1细胞是预测NICB获益的关键因素（图3H）。

在单独使用抗 PD-1 治疗的晚期不可手术 ESCC 的外部验证队列 1 中，CD8+ Tex-SPRY1 特征的高表达与更好的临床反应和改善的总生存率显著相关（图 3I-J），与PD-L1相比，在预测ICB反应方面具有更高的价值（图3K）。这个独立的ICB单独队列验证了CD8+ Tex-SPRY1细胞作为ESCC的ICB生物标志物的有效性。他们进一步分析了与ICB反应相关的特征，发现CD8+ Tex-SPRY1特征在预测临床疗效方面表现出最高的效率（图3L）。

图3. CD8+ Tex-SPRY1 预测 ESCC 免疫治疗的良好结果。

(A) NICB 治疗的 ESCC 验证队列示意图。(B-C)多重 IHC 染色的代表性图像。(D) CD8+ Tex-SPRY1 特征评分。(E) Kaplan-Meier 生存曲线分析。(F)验证队列 2 中 CR 预测的CD8 + Tex-SPRY1 特征或 PD-L1 表达的受试者工作特征 (ROC) 曲线 (AUC) 下面积。(G) CR 和 NCR 之间的 CD8 + Tex-SPRY1 特征评分。(H) 验证队列 2 中临床因素和 CD8+ Tex-SPRY1 无病生存率的多变量 Cox 回归分析的森林图。(I) CD8+ Tex-SPRY1特征评分在 ESCC 外部验证队列 1 (EVC1) 中得到验证。(J) 针对来自EVC1的CD8+Tex-SPRY1特征生成的 Kaplan-Meier 生存曲线。(K) CD8+ Tex-SPRY1 特征或 PD-L1 表达对 EVC1 中响应者预测的ROC 曲线。(L) 在接受免疫治疗的食管鳞癌两组（右组和左组）中区分应答者的预测因素的 AUC 值。

通过取三个独立研究中Tpex上调差异基因的交集，他们发现了Tpex相关基因的重叠，包括Spry1（图4A），从而证明其在Tpex和CD8+ Tex-SPRY1细胞的祖细胞样表型中的重要性。

接下来，他们进行了过继细胞转移实验，以检测肿瘤特异性CD8+ T细胞上的SPRY1的表达是否影响Tpex的比例。首先生成对照和Spry1过表达 CD8+ OT-I T 细胞，并通过免疫印迹分析Spry1的表达（图 4B-C）。这两种类型的 OVA 特异性 CD8+ OT-I T 细胞在接种后第 10 天转移到具有B16-OVA 肿瘤的小鼠体内。OT-I 转移后，受体小鼠腹腔注射同型 IgG 或抗 PD-1 抗体（图 4 B）。OT-I- Spry1组在抗 PD-1 治疗后表现出比 OT-I-Ctrl 组显著增强的抗肿瘤反应（显著抑制肿瘤生长）（图 4D）。在未接受ICB治疗的小鼠中，OT-I-Spry1组和OT-I-Ctrl组的抗肿瘤作用无显著差异。此外，他们进行了流式细胞分析，以评估Tpex在肿瘤浸润淋巴细胞中的比例（图4E-F）。在肿瘤特异性CD8+ T细胞中表达Spry1显著增加了Tpex的比例和数量(CD44+PD-1+LY108+TIM-3−CD8+)（图4G）。这些结果证明了scRNA-seq分析和临床验证，即CD8+ Tex-SPRY1细胞是祖细胞样Tpex，对免疫治疗的应答增强。

图4. CD8 + T 细胞中SPRY1的表达增加了 Tpex 的比例，并促进抗 PD-1 治疗肿瘤的反应。

(A) 三项独立研究中 Tpex 上调基因的交叉点。(B) OT-I T 细胞过继转移实验的示意图。(C)通过免疫印迹检测OT-I T 细胞中Spry1的过表达效率。(D) 平均肿瘤生长曲线。(E) OT-I T 细胞过继转移实验的示意图。(F) 小鼠肿瘤浸润转移 OT-I T 细胞中 Tpex 的代表性流式细胞术门控策略。(G)代表性流式细胞分析图。

骨髓来源的巨噬细胞可以极化为促炎/M1 或抗炎/M2，从而调节抗肿瘤免疫中的 T 细胞反应。对本项研究的 ESCC 数据中的骨髓细胞进行细分，确定了六个巨噬细胞聚类。比较NICB 之前 CR 和 NCR 肿瘤之间的转录组差异，发现 CR 组中巨噬细胞存在显著的 M1 极化，与促炎活性相关的表达特征增加（图 5 A），表明 ESCC 中的巨噬细胞偏向于促炎性与更好的 ICB 结果相关。在NICB前的CR患者的巨噬细胞亚群中，在Macro-MMP9、Macro-CXCL1和Macro-FOLR2亚群之间观察到M1特征和促炎活性的显著富集（图5B）。

他们假设T细胞可能塑造了促炎巨噬细胞表型，并研究了它们之间的相互作用。CD8+ Tex-SPRY1细胞与巨噬细胞的配体-受体相互作用最多。他们确定了CD8+ Tex-SPRY1细胞产生的细胞因子/趋化因子对巨噬细胞的生物学重要调节（图5C），其中IFNG和TNF显示出诱导促炎巨噬细胞的强大调节潜力。此外，他们观察到CD8+ Tex-SPRY1与M1样巨噬细胞亚群（Macro-MMP9、Macro-CXCL1和Macro-FOLR2）之间的潜在相互作用强于与其他巨噬细胞聚类之间的相互作用（图5D）。值得注意的是，M1样的Macro-MMP9细胞在基线和NICB后的细胞比例上都表现出与CD8+ Tex-SPRY1细胞的最高相关性（图5E）, 表明它们在抗肿瘤免疫中的相互作用。重点关注配体-受体对，Macro-MMP9细胞与T细胞表现出强烈的相互作用（图5F），并且Macro-MMP9与CD8+ Tex-SPRY1细胞之间的配体-受体数量是T细胞聚类中最高的。重要的是，Macro-MMP9 细胞产生了多种配体（IL15、CXCL9/CXCL10），具有丰富的调节潜力，可在CD8+ Tex-SPRY1 细胞中诱导 T 细胞激活特征（图 5 G），包括 IFNG、CCL3和CCL4，以促进可诱导促炎巨噬细胞的正前馈循环（图 5 C）。值得注意的是，这些潜在的细胞间相互作用在CR组和NCR组中都很常见，但在CR组中更强（图5F）。与NCR肿瘤相比，观察到治疗CR前肿瘤中Macro-MMP9和CD8+ Tex-SPRY1细胞同时富集（图5H-I）。

总的来说，他们发现促炎巨噬细胞与ESCC中祖细胞样CD8+ Tex-SPRY1细胞密切相关。Macro-MMP9和CD8+ Tex-SPRY1细胞表达的促炎信号分子显示出促进正前馈循环的潜力，从而进一步诱导其具有抗肿瘤免疫的细胞状态。

图5. 促炎性 Macro-MMP9 与 CD8 + Tex-SPRY1相互作用。

(A)基因集富集分析 (GSEA) 。(B) NICB 之前 CR 患者与 NCR 患者的巨噬细胞子集中特征显著富集的标准化富集评分 (NES) 热图。(C) 热图显示 CD8 + Tex-SPRY1 细胞中驱动巨噬细胞促炎表型的优先配体的活性（左）和调节潜力（右）。(D)不同反应组中从 CD8 + Tex-SPRY1 细胞到巨噬细胞亚群的重要配体-受体对的数量。(E) 巨噬细胞亚群与 CD8 + Tex-SPRY1 细胞的细胞比例的相关性。(F) 从 Macro-MMP9 细胞到 T 细胞亚群的重要配体-受体对的数量。(G) 热图显示 Macro-MMP9 细胞中优先配体的活性（左）和调节潜力（右），驱动 CD8 + Tex-SPRY1 细胞的抗肿瘤潜力。(H-I) 验证队列 1 中 CR 和 NCR 患者治疗前肿瘤的多重 IHC 染色的代表性图像。

最新的研究强调了 B 细胞和三级淋巴结构 (TLS) 在塑造 ICB 反应和促进 T 细胞介导的抗肿瘤活性方面的相关性。他们观察到ESCC 肿瘤中对 NICB 有反应的B 细胞与 CD8+ PD-1+SPRY1+细胞 (CD8+Tex-SPRY1) 共定位（图 6 A），特别集中在TLS内。他们发现 ESCC 中 NICB 治疗后 TLS 活性显著增加（图 6 B），特别是在 CR 组中。

接下来他们试图评估哪些B 细胞亚群对于 ESCC 中的 ICB 功效和 TLS 活性很重要。对 ESCC 数据中的 B 细胞进行细分，确定了幼稚 B (Bn)、记忆 B (Bmem) 和滤泡 B (Bfo) 子集。值得注意的是，NICB 治疗后 Bfo-NEIL1 细胞丰度增加，尤其是在 CR 后肿瘤中富集（图 6 C）。Bfo-NEIL1 细胞是与接受前期手术的 ESCC 中无病生存率改善最显著相关的 B 细胞聚类，与其他临床参数无关（图 6D）。这些结果凸显了 Bfo-NEIL1 细胞在免疫治疗和 ESCC 预后中的双重意义。Bfo-NEIL1 细胞中上调基因的功能富集分析支持了这一点，该分析揭示了与免疫反应激活和淋巴细胞激活相关的通路的富集（图 6 E）。这些观察结果表明，TLS 相关的 Bfo-NEIL1 细胞可能与 CD8+ Tex-SPRY1 和 Macro-MMP9 细胞相互作用，在 ESCC 的抗肿瘤免疫中发挥作用。

为了进一步研究它们之间关联的潜在机制/相互作用，他们接下来进行了细胞间相互作用分析。

在 B 细胞亚群中，预计 Bfo-NEIL1 细胞与 CD8+ Tex-SPRY1 细胞表现出最高的相互作用潜力（图 6 F）。有趣的是，Bfo-NEIL1 衍生的 IL23 预计具有强大的调节潜力，通过靶向 T 细胞激活/扩增/效应相关基因（例如IRF1、PRDM1、REL、BRD2和NFKBIZ）来激活 CD8+ Tex-SPRY1 细胞（图6G）。

最近的研究表明，B 细胞诱导 CD4+ T 滤泡辅助细胞 (Tfh) 依赖性 IL21 产生并促进 CD8+ T 细胞免疫，他们进一步研究了 TLS 相关的 Bfo-NEIL1 细胞与 CD4+ Tex-的相互作用CXCL13 细胞，表现出耗竭标记和 Tfh 特征。配体受体分析显示Bfo-NEIL1细胞具有很强的调控潜力，可通过B-T相互作用（ICOSLG/ICOS、CD40/CD40L和CD86/CD28）诱导CD4+ Tex-CXCL13细胞激活Tfh表型（图6H）。值得注意的是，CD4+ Tex-CXCL13细胞中的BCL6是Bfo-NEIL1细胞的重要调控靶点，Bfo-NEIL1细胞是Tfh细胞分化的强制性谱系转录因子。

重要的是，细胞-细胞相互作用分析预测CD8+Tex-SPRY1细胞可以通过激活的相互作用（IFNG/IFNGR、ITGLA/ICAM1和TNFSF14/HVEM信号）激活B细胞的功能（图6I），促进生发中心发育和抗原呈递。

总的来说，这些发现表明祖细胞样CD8+Tex-SPRY1细胞在 ESCC 中具有多方面的作用。除了充当响应免疫治疗的关键 T 细胞外，CD8+Tex-SPRY1细胞还与 TME 内的促炎巨噬细胞和 TLS 相关 B 细胞进行细胞相互作用，从而增强抗肿瘤免疫力。

图6. TLS 相关 B 细胞与 CD8+ Tex-SPRY1相互作用。

(A) CR 患者治疗后肿瘤的多重 IHC 染色的代表性 TLS 图像。(B) 不同群体的 B 细胞中 TLS 相关基因的表达。(C) B 细胞聚类的细胞组成。(D) 对 ESCC 无病生存的临床因素和 B 细胞聚类进行多变量 Cox 回归分析。(E) 与其他 B 细胞相比，Bfo-NEIL1 细胞中的通路富集。(F) B 细胞亚群和 CD8 + Tex-SPRY1 细胞之间重要配体-受体对的数量。(G) 热图显示 Bfo-NEIL1 细胞中优先配体的活性（左）和调节潜力（右），驱动 CD8 + Tex-SPRY1 细胞的抗肿瘤潜力。(H) 热图显示 Bfo-NEIL1 细胞中优先配体的活性（左）和调节潜力（右）。(I) 热图显示 CD8 + Tex-SPRY1 细胞中促进 B 细胞激活的优先配体的活性（左）和调节潜力（右） 。

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