文献解读|Front Pharmacol（5.988）：转录组分析揭示氟苯尼考抑制P19干细胞增殖和分化的分子机制

用FLO处理P19SCs 24或48小时，CCK-8检测结果表明：FLO以剂量和时间依赖性方式抑制细胞增殖（图1A）。然而，25 μg/ml 的FLO处理并未导致细胞培养上清液中LDH含量发生显著变化，表明FLO不会导致细胞死亡（图1B）。这表明FLO可抑制P19SCs的增殖，但不引起细胞死亡。

Sox2和Oct4是维持胚胎干细胞多能性所必需的蛋白。WB结果显示，FLO处理导致Sox2和Oct4蛋白表达水平显著下降，说明FLO抑制了P19SCs的多能性（图1C，D）。

图1 FLO抑制P19SCs的增殖和多能性

使用10 μg/ml FLO处理P19SCs 48小时后进行RNA-Seq，一共鉴定到2396个DEGs，其中1253个显著上调，1143个显著下调（图2A）。上调基因中，85个基因的差异倍数超过4倍，413个基因在2-4倍之间，755个基因在1.5-2倍之间；下调基因中，120个基因的差异倍数在0.25倍以下，351个基因在0.25-0.5之间，672个基因在0.5-0.66倍之间。

GO分析显示，DEGs显著富集到204个生物过程（BP），2个细胞组分（CC）和17分子功能（MF）条目中，前10个条目如图2B所示。此外，超过50个DEGs显著富集的BP类目有22个，且与胚胎发育相关，包括血管生成、胚胎器官发育、脉管系统发育的调节和器官的形态发生等（图2C）。

图2 DEGs和GO分析

KEGG分析表明，DEGs显著富集到45条通路，前20条通路分为6个亚类，分别为细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统（图3A）。在这些通路中，作者重点关注Wnt信号通路，它参与干细胞的增殖、维持以及胚胎发生。富集到Wnt通路中的DEGs有33个，包括15个上调基因和18个下调基因（图3B）。使用RT-qPCR检测了3个Wnt通路中的关键基因（Wnt3、Wnt8a和Myc）和3个其他基因的表达，结果和转录组测序数据一致（图4）。使用String数据库对33个DEGs进行PPI蛋白互作网络分析以进一步理解Wnt通路的功能（图3C）。接着用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化展示，同时使用Cytoscape中的cytoHubba插件分析了关键基因。结果表明，Axin2、Dkk1、Lef1、Sfrp2、Sfrp1、Fzd8、Wnt3、Fzd4、Tcf7和Wnt9a是Wnt通路中的关键基因（图3D）。

图3 KEGG、PPI分析及关键基因筛选

图4 RT-qPCR验证测序结果

作者进一步分析了β-catenin的表达，β-catenin是Wnt通路中最核心的信号转导因子。WB结果表明，FLO以剂量依赖性的方式降低β-catenin蛋白表达（图5A）。此外，FLO显著抑制P19SCs的胚状体形成，且在25 μg/ml FLO处理后，胚状体尺寸减小2倍（图5B）。同时，免疫荧光检测显示，FLO处理后β-catenin蛋白水平显著降低（图5 B）。使用CT 99021激活Wnt通路后，β-catenin的蛋白水平显著增加（图5C），同时促进了Myc和Ccnd1的mRNA表达（图5D），并部分逆转了FLO对P19SCs增殖的抑制作用（图5 E）。这表明Wnt信号通路在FLO诱导P19SCs增殖和分化毒性中起关键作用，但具体机制有待进一步研究。

图5 Wnt通路参与介导FLO诱导的毒性效应

对1237个上调基因和1124个下调基因进行PPI网络分析，然后用Cytoscape中的MCODE插件进行关键模块分析，分别得到上调（图6A）和下调（图6C）基因的关键模块。对涉及关键模块的DEGs进行GO和KEGG分析。GO分析结果表明：上调基因显著富集到的BP类目为“蛋白泛素化”、“溶酶体介导的泛素依赖性蛋白分解代谢过程”和“蛋白泛素化介导的泛素依赖性蛋白分解代谢过程”；显著富集到的CC类目为“SCF泛素连接酶复合物”、“细胞质”和“胞质溶胶”；显著富集到的MF条目为“泛素蛋白转移酶活性”、“连接酶活性”和“泛素蛋白连接酶活性”等（表1）。反之，下调基因显著富集到的BP类目为“DNA复制”、“DNA复制起始”和“RNA剪接”；显著富集到的CC条目为“细胞核”、“核质”和“剪接体复合体”；显著富集到的MF条目为“核苷酸结合”、“DNA结合”和“RNA结合”等（表2）。KEGG分析表明，上调基因显著富集到“泛酸介导的蛋白水解通路”（表１），下调基因显著富集到“DNA复制通路”、“剪接体”、“嘧啶代谢”和“细胞周期”（表２）。

表1 上调DEGs的重要模块的GO和KEGG分析

表2 下调DEGs的重要模块的GO和KEGG分析

通过Cytoscape的cytoHubba插件分析上调、下调基因中的关键基因。上调基因中，Itpkb、Egfr、Sirt1、Notch1、Lamp1、Pax6、Erbb2、Zbtb16、Ctsd和Fbxl3是关键基因（图6B）；下调基因中，Myc、Ubc、Cdc6、Pcna、Exo1、Ccnd1、Mcm4、Mcm3、Mcm7和Rrm2是关键基因（图6D）。对这些关键基因进行KEGG分析，发现7个下调的关键基因富集到细胞周期，包括Cdc6、Ccnd1、Mcm3、Mcm4、Mcm7、Myc和Pcna。其中，Mcm3、Mcm4、Mcm7、Myc和Pcna也涉及DNA复制。这表明DNA复制和细胞周期的异常调控可能在FLO诱导P19SC毒性中起重要作用。

图6 DEGs的关键模块和关键基因分析

表3 关键基因的KEGG分析

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