文献解读|NAT BIOTECHNOL（68.164）：番茄根际微生物群结构的改变使番茄具有抗枯萎病的能力

通过对抗性番茄和感病番茄根际宏基因组的比较分析，鉴定和组装了在抗性番茄根际微生物群中比在感病番茄根际中丰富得多的黄杆菌基因组，并培养了这种黄杆菌，命名为TRM1。

在盆栽试验中发现菌株TRM1可以抑制Ralstonia solanacearum引起的番茄青枯病。这一发现揭示了原生菌群在保护植物免受微生物病原体侵害方面的作用，为开发益生菌来改善植物疾病指明了道路。

根据16S rDNA扩增子焦磷酸测序，比较试验中的Hawaii 7996、Moneymaker、韩国卷心菜、非根际散土的土壤群落结构。散土和种植土壤的细菌群落结构存在显著差异:在检测到的24个门中，有8个门的相对丰度在散土和种植土壤之间存在显著差异。

图1 基于16S rDNA扩增子焦磷酸测序的中土壤群落结构的比较

(a) 门级分类比较   (b) 科级相对丰度的相关性

在散土中，Proteobacteria, Acidobacteria, unclassified phylum, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria ，Gemmatimonadetes是检测到的主要门(图1a)。根际土壤中，Bacteroidetes , Firmicutes , Verrucomicrobia , Ignavibacteriae , Proteobacteria and BRC1的丰度显著高于散土，而Acidobacteria ，Gemmatimonadetes的丰度显著低于散土。

根际群落之间的差异在活跃生长和开花时期比在衰老时期更明显，对于番茄根际样品，两次采样时间之间的差异比两个品种之间的差异更明显。

番茄中丰富的门包括Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, unclas sified phylum ，Firmicutes；并且Proteobacteria，Flavobacteriia, Alphaproteobacteria ，Betaproteobacteria 在生长和开花阶段的比例较高。在Hawaii 7996的根际，Flavobacteriaceae ， Sphingomonadaceae与散土相比无统计学显着增加，在 Moneymaker 中unclassified Alphaproteobacteria, Oxalobacteraceae and Bacillaceae也是如此(图1b)。

在Moneymaker土壤中种植的Hawaii 7996的症状发展更快( 快2 d )。相比之下，移栽到Hawaii 7996土壤中的Moneymaker植株，14 d的疾病发展斜率较低，疾病严重程度降低了27.7%。

用稀释法分离出477种不同的细菌，发现其中培养的31株黄杆菌菌株对番茄幼苗具有生长促进作用并抑制马铃薯晚疫病菌，辣椒疫霉菌或立枯丝核菌的生长活性。推测Hawaii 7996根际微生物群延缓了病原菌在木质部导管的入侵和定殖。

图2 番茄品种移栽试验及对R. solanacearum的反应

(a) Hawaii 7996和Moneymaker移植试验方案   (b) 番茄品种上的青枯病的进程

宏基因组学分析显示，黄杆菌科在Hawaii 7996根际微生物群中占主导地位，利用分类学重建一个来自番茄根际的黄杆菌基因组，该基因组由57个等位基因组组成，长度为4.11 Mb，没有rRNA操纵子，命名为TRG1（图3b）。这是第一个从番茄根际组装的微生物基因组。使用13个保守蛋白质序列对255个黄杆菌基因组和TRG1进行系统发育分析，将TRG1置于Gaetbulibacter saemankumensis DSM 17032的旁边（图3c），并将对应于TRG1的菌株标记为黄杆菌科中一个潜在的新分类分区。

图3 宏基因组衍生的黄杆菌科基因组的构建与重建

scaffolds的聚类和分类学分配 (b) 重组基因组的圆形表示 (c) 黄杆菌属的系统发育树 (d) 三个黄杆菌科基因组的折叠覆盖率

将TRM1（对应于TRG1的假定未培养微生物）的基因含量与TRM1同一分支的八个海洋分离菌株以及两个土壤分离菌株RCH33和DSM 17708进行了比较。TRM1与八个海洋分离菌株共有1199个基因，构成谱系的核心基因集。

TRM1也有128个“生态位特异性”基因，这些基因在8个海洋分离菌株中不存在，但在两个土壤分离菌株中是常见的。在TRM1中，有28个ECF sigma因子（图4a）用于检测环境线索，23对SusC/SusD用于碳水化合物利用（图4b），这可能有助于根际适应性。

图4  TRM1中的σ因子和淀粉利用系统蛋白。

(a) σ70家族的σ因子的辐射树   (b) SusC和SusD的圆环树

系统发育分析表明，TRM1与海洋细菌有亲缘关系，含有卡那霉素抗性基因，所以选择了含有2%氯化钠和30µg/ml卡那霉素的1:10稀释海洋肉汤作为培养基。获得了22个候选TRM1菌落，其中一个为粉红色菌落，其余为黄色菌落。

所有的分离株都使用了结合TRG1序列信息和来自围隔实验的元数据设计的三套 PCR 引物，产物序列证实它们是TRG1序列。

与未经处理的对照组相比，用TRM1-10处理过的土壤上生长的的番茄的青枯病的发展明显受到抑制（图5c）。一些黄杆菌，包括F. aquidurense RC62, F. daejeonense RCH33， Flavobacterium sp. TCH3-2对番茄具有促生长作用。比较了TRM1和这些细菌对生长在非无菌或无菌土壤中的Moneymaker植物的生防活性，TRM1-10抑制了非无菌土壤中的青枯病（图5d），而其他测试菌株均未抑制青枯病。

图5 黄杆菌科菌株TRM1-10及其对Moneymaker青枯病进程的影响。

(a) 生长在海洋琼脂上的TRM1-10细胞的显微图像。比例尺为10 µm。(b)生长在海洋琼脂上的TRM1-10细胞的扫描电子显微照片。比例尺为2.5 µm。(c) 用TRM1-10处理的Moneymaker的青枯病的进程。(d) 用TRM1-10、F. aquidurense RC62、F. daejeonense RCH33、Flavobacte处理的Moneymaker的青枯病的进程。

该实验进一步研究了TRM1-10和R.solanacearum的种群动态（图6a）。TRM1-10处理的Hawaii 7996根际土壤中 TRM1-10的种群数量在2 × 10 8 CFU/g 左右逐渐下降，1周后稳定在2.48 ± 0.79 × 10 6 ~ 2.67 ± 3.07 × 10 6 CFU/g, 2周后，TRM1-10的数量维持在2.62±1.06 × 10 5 CFU/g. Moneymaker 根际土壤中TRM1-10的种群数量下降至1.06±0.48×10 5 ~1.44±1.17×10 6 CFU/g，在2周内恢复到1.81±0.82×105 ~3.44±3.17×10 4 CFU/g（图6b、d）。

值得注意的是，用 TRM1-10＋R.solanacearum处理的Moneymaker根际中的 TRM1-10种群数量，在1周时比单独用 TRM1-10处理的 Moneymaker根际中的TRM1-10种群数量高三倍以上(图6c)。

图6  Hawaii 7996、Moneymaker中TRM1-10 和 R. solanacearum 的种群动态

(a) 用于菌落计数和qPCR的根际土和散土取样的实验方案 (b) Hawaii 7996 根际中TRM1-10种群随时间的变化 (c,d) 接种R. solanacearum 、不接种R. solanacearum的Moneymaker根际中TRM1-10的种群变化 (e,f) 在有或没有TRM1-10预处理的情况下，Moneymaker的根际中R. solanacearum 的种群变化。