文献解读|Food Chem Toxicol（5.572）：双酚A暴露通过抑制雄性小鼠海马体线粒体氧化磷酸化降低学习能力

双酚A（BPA）是一种干扰内分泌系统的化学物质，广泛用作医疗设备制造业和食品加工业。在日常生产使用过程中，BPA可渗透到家庭环境、水和食品中，人类不可避免地通过吸入和皮肤接触以及受污染的水和食物而增加BPA的暴露风险。研究表明，BPA暴露对各种器官系统的异常具有永久和不可逆的影响，包括免疫、神经系统、心血管、肾脏和生殖系统等。但是，BPA影响学习能力的深层机制尚不清楚。海马体是大脑中与学习和记忆有关的重要区域，BPA对动物海马体的损伤作用尚缺乏研究。因此，本研究通过转录组测序，探究BPA暴露对雄性小鼠海马体转录组的影响，以阐明BPA影响小鼠学习认知能力的分子机制。

在野外试验中，通过总移动距离评价动物的运动活动。相反，动物的探索行为则是通过进入试验区域的次数、花费的时间和移动到中心区域的距离来评估的。各组小鼠在总移动距离和中心区域内移动距离方面无显著差异（图1A，C）。和对照组相比，H组小鼠花费时间更少，M组和H组小鼠进入中心区域的次数也更少（图1B，D）。为了评价小鼠的认知功能，各组小鼠进入八臂迷宫测试空间记忆能力。和对照组相比，H组小鼠在第2次、第3次和第7次测试时的参考记忆错误次数增加，随着测试次数的增多，错误次数呈现下降趋势（图1E）。和对照组相比，H组的工作记忆错误次数在第7次和第9次时也显著增加（图1F）。这表明BPA影响了小鼠的行为和学习认知能力。

图1 BPA对小鼠行为的影响

BPA处理组和对照组之间的摄食量、饮水量、体重和海马体器官系数均无显著差异（数据未提供）。

海马体由齿状回（DG）和海马区（CA）构成，其中海马区分为4个锥体细胞区，即CA1-CA4。对照组小鼠的DG、CA1和CA3区的细胞排列规则且致密，但是H组小鼠的DG区域内神经细胞数量减少（图2A），同时M组和H组小鼠DG区域内神经细胞呈现不规则且松散排列（图2B），CA3区域内神经细胞数量无显著变化（图2C）。

图2 BPA对小鼠海马体的组织形态学影响

与对照组相比，BPA在较高剂量下可显著降低睾酮浓度（图3A）。M组和H组小鼠的雌二醇浓度显著增加（图3B），因此，雌二醇/睾酮的比值呈剂量依赖性降低（图3C）。

图3 BPA对雌二醇和睾酮的影响

转录组测序数据表明，各组间样本的重复性高，相关分析表明R2>0.9（图4A）。和对照组相比，L组共鉴定到3309个DEGs，其中1569个上调，1740个下调；M组共鉴定到1796个DEGs，其中828个上调，968个下调；H组共鉴定到1055个DEGs，其中502个上调，553个下调（图4B-D）。各组间DEGs的Venn图如图4E所示。

图4 各组间DEGs分析

由于在野外试验和八臂迷宫测试中，与对照组相比，高剂量BPA（H组）对小鼠的探索能力和认知能力的影响更为显著。因此，选择H组和对照组之间的DEGs用于GO和KEGG分析。聚类分析展示了对照组和H组之间DEGs表达趋势（图5A）。GO分析表明，DEGs最显著富集的生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）分别为对病毒的防御、核糖体亚基和核糖体结构组分，DEGs还显著富集到NADH脱氢酶活性、物质运动偶联的ATP酶活性和作用于醌和NAD（P）H的氧化还原酶活性等与氧化磷酸化（OXPHOs）过程相关的类目（图5B）。在KEGG分析中，显著富集的通路是阿尔茨海默病（AD）、产热作用、核糖体、亨廷顿病（HD）、OXPHOs和帕金森病（PD）等（图5C）。与学习记忆相关的信号通路有AD、PD和HD，三种通路中有16个基因是重叠的（图5D）。

图5 DEGs的GO和KEGG分析

一共23个DEGs显著富集到OXPHOs通路，其中16个DEGs与AD、PD和HD通路中的DEGs（定义为神经系统紊乱DEGs）重叠（图6A，B）。这些结果提示OXPHOs的变化可能与BPA诱发神经系统紊乱共病症（小鼠学习和记忆能力下降）的过程有关（图1）。

图6 OXPHOs通路中的DEGs分析

为验证测序数据的准确性，选择9个和海马体认知能力有关的DEGs (Ndufa3、Ndufb10、Ndufs8、Uqcrh、Uqcrb、Cox6b1、Cox7b、Cox7c和ATP5G1) 进行RT-qPCR验证，结果和测序数据一致，表明测序数据的准确性（图7）。

图7 RT-qPCR验证

从图6B中预测Ndufb10的log2|FC|值的更大，因此对其进行WB验证。和对照组相比，H组Ndufb10蛋白表达显著下降（图8A），这和测序数据及RT-qPCR检测结果一致。

图8 Ndufb10蛋白表达及OXPHOs呼吸链复合物活性分析

A中的1、2、3和4分别代表对照组、L组、M组和H组

为了研究OXPHOs在BPA降低小鼠学习记忆能力中的作用，作者测定了线粒体呼吸链中4种复合物的活性。和对照组相比，M组和H组的复合物I（NADH-CoQ氧化还原酶）、复合物Ⅲ（辅酶Q-细胞色素C氧化酶）、复合物Ⅳ（细胞色素C氧化酶）和复合物Ⅴ（ATP酶/ATP合酶）的活性显著降低（图8B-E）。这表明BPA可以损害海马体组织线粒体OXPHOs过程，从而造成能量代谢异常和认知功能缺陷。

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