文献解读|Nat Commun（16.6）：空间分辨转录组学揭示弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中巨噬细胞的异质性和预后意义

弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) 是成人非霍奇金淋巴瘤最常见的亚型，利妥昔单抗与环磷酰胺、阿霉素、vincristine和prednisolone (R-CHOP) 的联合治疗可能具有治愈作用，但 30%–40% 的病例在初始治疗后复发。阐明 R-CHOP 后复发的机制对于制定改善 DLBCL 结局的治疗策略至关重要。

肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 是 DLBCL 肿瘤微环境(TME)中富集的免疫细胞。由于 TAM 在肿瘤进展、转移和复发中的作用，TAM 是肿瘤学中的潜在治疗靶点。在 DLBCL 中，TAM 浸润与 R-CHOP 治疗后的不良预后相关。然而，研究之间存在差异，缺乏足够的重现性来确定一致的临床预后标志物。

研究者团队使用GeoMx®DSP 全转录组图谱(WTA)，通过对形态学标记CD68、CD3和CD20（分别与巨噬细胞、T细胞和B细胞有关）的免疫荧光染色产生的不同掩膜选择性收集紫外线可切割探针，对反应性淋巴组织(RLT)和DLBCL患者共702个感兴趣区域(aoi)的巨噬细胞、T细胞和B细胞的整个转录组进行了分析（图1A）。

鉴于 DLBCL 微环境的异质性和高细胞性，他们使用公开的 RLT 和 DLBCL 样本的 scRNA-seq 数据交叉验证。

然后，他们使用累积密度函数在基于 DSP 的 CD68+（巨噬细胞）、CD20+（B 细胞）和 CD3+（T 细胞）AOI 上测试了这些特征，发现巨噬细胞特征在 CD68+ AOI 中富集，而 T 细胞和 B 细胞的特征分别在 CD3+ 和 CD20+ AOI 中富集（图 1D-E）。这表明基于形态标记的 AOI 可以准确捕获各自感兴趣的细胞类型，从而能够收集巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞在其天然组织环境中的不同全转录组谱。

图1. 数字空间分析 (DSP) 阐明了淋巴组织微区域中不同掩模的一致轮廓。

(a) 实验流程示意图。(b-c)免疫荧光染色。 (d-e) 累积密度函数显示细胞的富集程度。

他们接下来的目标是研究rlt不同空间区域内CD68+巨噬细胞的转录组学差异。通过差异表达基因(DEG)分析，观察到997和755基因分别在生发中心(GC)和滤泡间(IF)巨噬细胞中差异上调，表明基因表达模式非常不同（图2A）。热图显示了生发中心GC和IF区高表达的前10个deg（图2B）。细胞增殖和代谢相关通路如E2F靶点、MYC靶点和氧化磷酸化在GC巨噬细胞中富集（图2C）。这些增殖通路对包括骨髓祖细胞和分化巨噬细胞在内的多种细胞类型至关重要。相反，IF中富集的通路主要与免疫应答相关，如干扰素γ应答和TNF-α/NF-κB通路。有趣的是，IF中的巨噬细胞显示S100A家族成员（钙结合蛋白）的上调，例如S100A4、S100A8和S100A9，它们是调节巨噬细胞生物学的已知损伤相关分子模式(DAMP)分子。

GC由两个功能不同的区室组成：暗区(DZ)和亮区 (LZ)，这种区室化对于 GC 内 B 细胞的动态分化至关重要。他们还比较了 LZ 和 DZ 中巨噬细胞的 DEG。他们还注意到GC在解剖学上不同的区室中的巨噬细胞之间的基因表达存在显著差异（图2D）。补体模式识别成分C1QA、C1QB和C1QC在 DZ 巨噬细胞中显著上调（图 2D），补体通路的 Hallmark 基因集的其他成分也是如此（图 2E）。这表明非特化补体系统功能在 RLT DZ 中巨噬细胞极化中可能发挥作用。

基于上述不同空间位置巨噬细胞的比较，他们从各自的deg中获得巨噬细胞特征（以下称为MacroSigs）。rlt中与空间区室相对应的MacroSigs（由上调的DEG产生）包括：MacroSig1 (GC)、MacroSig2 (IF)、MacroSig3 (LZ)和MacroSig4 (DZ)。然后，他们评估了这些空间衍生的macrosig是否可以映射到通过scrna-seq产生的已知巨噬细胞亚群，使用了一个名为MoMac-VERSE的综合数据集，这是目前最大的人类单核细胞和巨噬细胞Meta分析，其中包括来自41个scRNA-seq数据集的17个带注释的单核细胞/巨噬细胞亚群，涉及13个健康和病理组织（图2F）。他们将MacroSigs的前50个基因投射到MoMac-VERSE上，注意到MacroSig1 (GC)与TREM2+巨噬细胞重叠（图2G）。有趣的是，尽管与GC巨噬细胞有明显的转录差异，但MacroSig2 (IF)是分散的，并且不覆盖由MoMac-VERSE定义的一个或多个特定的巨噬细胞亚聚类（图2H）。这提出了一种可能性，即来自淋巴组织不同区域的MacroSigs可能表示迄今未知的巨噬细胞亚型（未在MoMac-VERSE荟萃分析中表示）。此外，MacroSig3 (LZ)定位于MNP/T细胞双联体（图2I），而MacroSig4 (DZ)与HES1/FOLR2巨噬细胞群重叠（图2J）。这些结果表明这些巨噬细胞亚群可能在淋巴组织的不同区域发挥特定作用，值得进行功能研究。

图2. 独特的基因表达模式区分反应性淋巴组织内不同空间位置的巨噬细胞。

(a) 火山图显示 GC 和 IF 之间巨噬细胞的 DEG。(b) 根据热图中调整后的P值显示前 20 个巨噬细胞 DEG。(c) 对 GC 和 IF 之间的所有 DEG 进行通路富集分析。(d) 火山图显示了 LZ 和 DZ 之间的巨噬细胞 DEG。(e) 对 LZ 和 DZ 之间的所有巨噬细胞 DEG 进行通路富集分析。(f) MoMac-VERSE 使用来自 13 个健康组织和癌症组织的 41 个 scRNA-seq 数据集的汇编注释了 17 个 TAM 亚聚类。(G-J) 将每个MacroSig1-4中前50个基因分别投射到MoMac-VERSE上。

接下来，他们将 RLT 生发中心 (GC) 区域的巨噬细胞的基因表达与 DLBCL 样本中的巨噬细胞的基因表达进行了比较。这两个巨噬细胞亚群的 DEG 突出表明，RLT GC 和 DLBCL 巨噬细胞中分别有 895 个和 468 个独特基因差异上调（图 3A）。热图显示了RLT和DLBCL中高表达的TOP DEG（图3B），并将这些 DEG称为 MacroSig5 (RLT) 和 MacroSig6 (DLBCL)。促肿瘤巨噬细胞的标记物CD163以及补体模式识别成分（C1QA、C1QB和C1QC）在 DLBCL 巨噬细胞中显著上调。DLBCL MacroSig 中的富集通路主要与免疫反应有关，例如干扰素反应和补体通路（图 3C）。使用 MoMac-VERSE，他们鉴定 MacroSig6 (DLBCL) 投射到 IL4I1+ 巨噬细胞群（图 3D），这是一个在不同癌症类型中体现免疫抑制功能的巨噬细胞子集。

这些结果表明了 IL4I1+ 巨噬细胞在 DLBCL 发病机制中的潜在作用，并为探索这些细胞的靶向提供了前景。

图3. 反应性淋巴组织和恶性淋巴组织之间巨噬细胞的独特转录组谱。

(A) 火山图显示 RLT 和 DLBCL 之间的巨噬细胞 DEG。(B) 热图显示RLT 和 DLBCL 之间的排名靠前的DEG 的热图。 (C) 通路富集分析。(D)UMAP可视化。

DLBCL患者的亚型基于B细胞起源(COO)基因表达谱(GEP)。他们在 8 个公开的转录组数据集中探索了 DLBCL 患者的bulk RNA 基因表达谱中 MacroSig 的富集。在所有数据集中，MacroSig1 (GC)在生发中心b细胞样(GCB) DLBCL中富集，MacroSig2 (IF)在未分类(UNC) DLBCL中富集，MacroSig6 (DLBCL)在活化b细胞(ABC)亚型DLBCL中富集（图4A-B）。MacroSig3 (LZ)和MacroSig4 (DZ)在任何COO类别中都没有明显富集（图4C）。

在DLBCL scRNA-seq数据集中，他们的macrosig在单核巨噬细胞群体的不同聚类中富集（图4D）。大多数MacroSig在DLBCL B细胞群中显示出可忽略的模块得分（图4D），它们与DSP实验中的GC/RLT B细胞特征共有几个细胞周期/增殖基因。该分析表明，MacroSigs 确实可能代表 GEP 分析中的巨噬细胞。

图4. 空间来源的 MacroSig 与 COO DLBCL 子分类相关。

(A) MacroSig1 (GC)和MacroSig2 (IF)在DLBCL患者的bulk RNA基因表达谱的DLBCL COO分类中富集，这些数据来自8个公开的转录组数据集。(B) 在上述8个数据集中，MacroSig5 (RLT)和MacroSig6 (DLBCL)在DLBCL COO分类中富集。 (C) 在上述8个数据集中，MacroSig3 (LZ)和MacroSig4 (DZ)在任何COO类别中均未明显富集。(D) 每个MacroSig的所有基因，通过其各自的模块评分，投射到DLBCL scRNA-seq数据集的单核/巨噬细胞和B细胞亚群上。

最后，它们的目的是使用上述八个临床注释的 DLBCL 数据集评估 DLBCL 临床样本的大量基因表达数据时，空间来源的 MacroSig 是否具有预后意义。MacroSig6 (DLBCL) 富集的病例比 MacroSig5 (RLT) 富集的病例具有更短的总生存期(OS)（图 5A-I）。

与富含 MacroSig6 (DLBCL) 的病例相比，富含 MacroSig5 (RLT) 的患者可能代表那些免疫抑制性TAM 较少的患者。这一结果还强调，巨噬细胞衍生的基因特征的应用可能在这些肿瘤的大量基因表达数据中保持临床相关性。然而，他们观察到，在多个 DLBCL 数据集中，与 MacroSig3 (LZ) 患者相比，具有 MacroSig4 (DZ) 的 DLBCL 患者的 OS 明显较差（图 6A-I）。

图5. 空间来源的 MacroSig5/6 (RLT/DLBCL) 对 DLBCL 数据集中的患者生存进行分层。

(A) 森林图描绘单变量 Cox 比例风险模型分析。(B-I)生存分析。

图6. DLBCL 数据集中的空间衍生 MacroSig3/4 (LZ/DZ) 患者生存分层。

(A) 描述单变量 Cox 比例风险模型分析的森林图。 (B-I)生存分析。

他们评估了从本项研究的DSP实验中获得的B细胞暗区特征对预后的影响，并将其与从DZ-MacroSig4中获得的结果进行比较。基于B细胞的DZ信号确实是具有预后价值的（图7A），但其一致性不如DZ-MacroSigs（图6A）。值得注意的是，在B细胞衍生的和巨噬细胞衍生的LZ-和DZ-特征之间只有少数基因有（MacroSig3-4）（图7B），这突出表明具有这些不同暗区生物学方面特征的DLBCL（B细胞和巨噬细胞）具有不良结果，但可能通过不同的生物学机制。

由于补体模式识别成分基因（C1QA、C1QB和C1QC）在DZ信号（MacroSig4）中显示为TOP基因，并且由于表达C1Q的巨噬细胞是一个确定的实体，他们估了RLT中C1Q的免疫荧光染色。使用与暗区标记AID的联合染色，他们注意到，与rlt生发中心的亮区(LZ)相比，表达C1Q的巨噬细胞确实在暗区(DZ)富集（图7C）。在CMMC DLBCL病例队列中，他们观察到巨噬细胞中C1Q表达高的患者比巨噬细胞中C1Q表达低的患者生存率更低（图7D-F）。

图7. DLBCL 中暗区 MacroSig 标志 C1Q 的附加评估。

(A) 森林图描绘单变量 Cox 比例风险模型分析。(B) 维恩图显示了 LZ、DZ 样 B 细胞特征和 MacroSig3-4（LZ 和 DZ）的重叠基因。(C) 显示了 RLT 的免疫化学染色。(D) DLBCL 组织中免疫荧光染色的 CD68 + C1Q+ 细胞。 (E) 生存分析。(F) 图形摘要总结了空间派生 MacroSig 的推导，并描述了它们与巨噬细胞/DLBCL 生物学和临床结果的已知特征的关联。

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