文献解读|Nat Commun（16.6）：Omicron BA.2 突破性感染对免疫代谢平衡的长期影响：一项为期 6 个月的前瞻性研究

已有长期冠状病毒病(long COVID)和突破性感染(BTI)的报道；然而，Omicron BTI 后长期 COVID 的机制和病理特征仍不清楚。

为了评估轻度 BA.2 BTI 后的长期器官损伤，研究者团队检查了 2 次 Convidecia 疫苗接种的恢复期患者接受 Omicron BA.2 BTI 后的临床肝脏和肾脏参数。观察到蛋白质合成减少，BTI 后三个月血清总蛋白和白蛋白水平下降，然后 BTI 后六个月恢复到正常水平（图1a-b）。肝酶胆碱酯酶(CHE)和α-L-岩藻糖苷酶(AFU)水平在BTI后三个月升高，然后在三个月后急剧下降（图1b），表明BTI后3个月肝脏受损，6个月恢复。其中，BA.2-BTI-3m组丙氨酸转氨酶(ALT)和γ-谷氨酰转移酶(GGT)水平升高的个体较多（图1b）。

此外，BA.2 BTI 后三个月观察到轻度肾损伤，伴有酸性尿液、低尿比重、低血尿素氮 (BUN) 水平、高血清 β2-微球蛋白 (β2-MG) 水平和血清电解质水平波动（钾、钙、氯和磷）（图 1c），表明体内肾小球滤过、肾小管重吸收、代谢和渗透压水平存在潜在损害。这些变化在 BTI 后六个月恢复到正常水平（图 1c）。

为了评估轻度 BA.2 BTI 是否对造血系统产生长期影响，他们分析了红细胞 (RBC)、血小板 (PLT) 和白细胞的水平，这些细胞对于宿主免疫防御、伤口愈合、抗原清除和免疫功能至关重要（图 1d）。在 BA.2-BTI-3m 组中观察到大量红细胞（图 1d）。轻度BA.2 BTI后三个月，淋巴细胞百分比(Lym%)数量仍然明显，但绝对淋巴细胞计数没有显著下降（图 1d）。相应地，中性粒细胞(Neu%)和单核细胞(Mono%)的百分比增加（图 1d）。BA.2 BTI后三个月绝对单核细胞计数保持较高水平，但六个月后恢复到正常水平（图 1d）。

图1. Omicron BA.2 突破性感染 (BTI) 康复者的研究设计和常规血液检查结果。

(a) 研究设计的示意图。(b) BA.2 BTI 后三个月和 BA.2 BTI 后六个月肝功能参数的变化。(c) 肾功能及发电细胞参数变化。(d) BA.2 BTI 后三个月和 BA.2 BTI 后六个月主要红细胞和白细胞水平的动态变化。

用2次conconia疫苗和BA.2 BTI混合免疫可产生针对原型、Delta、BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.4/5、BF.7、BQ.1和BQ.1.1亚变异体的持久和广泛中和抗体(nab)，并对SARS-CoV产生中度交叉中和作用至少6个月（图2a-h）。然而，对XBB、XBB.1.5和CH.1.1亚型有有限的中和作用（图2i-j）。BTI组的所有结果均显著高于对照组（图2）。这表明体液免疫反应在BTI后6个月仍保持活跃，并对某些潜在的广泛关注的病毒突变体(VOC)感染保持一定的预防作用。

图2. SARS-CoV-2 康复者血清中针对 SARS-CoV-2 变种假病毒的中和抗体水平。

(a) SARS-CoV-2 变体刺突蛋白的突变。(b-o) 50%假病毒中和滴度(pVNT50)分析。

接下来，为了确定驱动长期影响的潜在因素，他们使用蛋白质组分析来全面表征 BA.2 BTI 后六个月恢复期患者血清蛋白质组的变化。本研究在 18 个样本（包括 10 名轻度 BA.2 BTI 康复者和 8 名健康人，所有样本均来自男性参与者）中共鉴定出 1824 个蛋白质。结果显示BA.2-BTI-6m和对照组的蛋白质表达谱分为两个聚类（图 3a）。与BA.2-BTI-6m组中的对照相比，差异分析鉴定出22个显著上调的蛋白质和58个显著下调的蛋白质（图 3b-c）。BTI组中主要上调的蛋白由基因IGKV1D-33、UNC13D、CARHSP1、SYTL4、LIMS1和ARHGAP45编码，而下调的蛋白包括MT-CO2、ATP5MG、ALDH7A1、PLCXD1和SULT2B1（图 3b）。仅在对照组中检测到 PSMD12、PHGDH、DNASE1L2和RDH12 （图3b）。功能分析显示，上调的蛋白主要涉及肌动球蛋白结构、伤口愈合、PLT、单核细胞迁移、细胞粘附和GTPase活性，表明轻度BA.2 BTI 后六个月，机体仍处于应激和免疫激活状态（图 3d）。下调的蛋白主要涉及核糖核苷酸、核苷酸代谢、ATP合成、线粒体代谢和质子跨膜转运，表明恢复期患者的物质代谢和氧化供能受到长期影响（图3d）。他们观察到BA.2-BTI-6m组的整体免疫和细胞免疫状态更加活跃。与免疫系统相关的上调可变蛋白，尤其是那些涉及对外来抗原（病毒、细菌和寄生虫）免疫的可变蛋白，比下调的可变蛋白更多（图S3a）。具体而言，BA.2-BTI-6m组中的一些多功能蛋白，例如F11R、CSRP1、LIMS1、PPKAR1A、CD47和SYTL14基因编码蛋白，共同维持活性生物信号（图 3e）。相反，由ATP5MG、ATP5F1C、ATP5PD、ATP5PO、COX2、DLD、DLST、ENO3、PGK2、PGM1和FASN编码的关键蛋白下调，共同下调多种代谢相关通路，包括ATP、核苷酸和蛋白质代谢（图 3f）。蛋白-蛋白相互作用分析表明，由CD47、MFGE8、EPX、F11R、TFPI、ILK、ITGA2B、FCER1G、PHGDH、LMNA和FASN编码的连接蛋白参与了免疫、凝血和代谢的两条或两条以上相关通路，在这些通路的调控中发挥了关键作用（图S3b）。

图3. BA.2-突破性感染(BTI)-6m 组和对照组之间外周血单核细胞差异的蛋白质组学分析。

(a) 树聚类图描述了两组之间的样本分离。(b) 火山图显示了两组之间的差异蛋白。(c) 热图显示了对照组和 BA.2-BTI-6m 组中的差异蛋白。(d) 气泡图显示富集的差异表达蛋白的生物学过程和功能。(e) 桑基图显示了上调蛋白质和富集生物过程之间的关系。(f) 桑基图显示下调蛋白质和富集生物过程之间的关系。

图S3. 可变蛋白和蛋白-蛋白相互作用分析。

(a)与对照组相比，BA.2-BTI-6m的可变蛋白分布。该图显示了每个Level2 KEGG通路上注释的可变蛋白的比例(%)。(b)可变的蛋白质-蛋白质相互作用。

为了进一步了解 BA.2-BTI 后六个月患者的恢复情况，他们使用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 来评估外周血单核细胞 (PBMC) 组成、基因表达和免疫组库的变化。他们鉴定了18种细胞类型，包括CD4 T细胞亚群、CD8 T细胞亚群、γδ T细胞(gdT)、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞(Mono)、树突状细胞(DC)、浆细胞样树突状细胞(pdc)和PLT（图4a-c）。这些细胞类型在对照组和BA.2-BTI-6m组之间分布均匀，批间效应不显著（图4b）。此外，他们使用更精细的Milo算法来识别细胞聚类丰度的潜在差异，发现对照组和BA.2-BTI-6m组之间的多细胞比例没有显著差异（图4d-f），这表明细胞比例恢复到正常水平，与临床实验室检查结果一致。他们还计算了不同细胞类型的差异表达基因(deg)，发现NK细胞的deg数量最多，表明它们的基因表达在长期内受到影响（图4g）。此外，他们检查了不同细胞类型中 DEG 富集的功能模块，发现 PBMC 共有的激活模块集中响应未折叠或拓扑错误的蛋白质、转录、白细胞/T 细胞激活和抗原呈递、内在凋亡信号传导等（图 4h）。相比之下，共有的下调模块集中在细胞质翻译、核糖体加工和组装、ATP代谢过程和蛋白质泛素化调控（图 4i）。

图4. scRNA-seq表征了外周血单核细胞 (PBMC) 的细胞和分子变化。

(a) UMAP图表显示 PBMC 的细胞类型和聚类。 (b) UMAP图显示了对照组和BA.2-BTI-6m组中PBMC的细胞类型和聚集。(c) 具有对应于不同细胞类型的标记基因的点图。(d) 堆叠条形图显示单个样本中不同细胞类型的比例。(e) UMAP图显示了对照组和基于Milo算法识别的BA.2-BTI-6m组之间细胞组成的差异。(f) 显示了基于 Milo 算法识别的对照组和 BA.2-BTI-6m 组中细胞组成的差异倍数。(g) 对照组和BA.2-BTI-6m组不同细胞类型中差异表达基因的数量。 (h) 气泡图显示不同细胞类型中显著上调的基因富集的生物功能。(i) 气泡图显示不同细胞类型中显著下调的基因富集的生物功能。

接下来。他们重点关注 NK 和 CD14 Mono 细胞（图5a），它们表现出更多的 DEG（图 4g）。他们检测了 NK 细胞效应蛋白（如颗粒酶和穿孔素）的变化。结果显示，BA.2-BTI-6m组中GZMH和GNLY显著上调，而GZMB、PRF1和IFNG显著下调（图5b）。NK细胞有305个DEG，上调最多的基因是TUBB4B、MTRNR2L12、FOSB、TUBA1B和KLF2等，而下调最多的基因是XCL1、IFITM3、LAIR2、CCL4和MYOM2等（图 5c）。功能分析表明T细胞激活、病毒应答、白细胞粘附、白细胞免疫和干扰素等相关过程的富集（图 5d）。他们进一步将CD4单核细胞聚集成4个聚类，并试图确定单核细胞状态 1 (MS1) 细相关亚群，这些亚群与严重的COVID-19和败血症相关，其在感染后6个月的变化尚不清楚。结果表明，聚类0是潜在的MS1，MS1标记如ALOX5AP、RETN、THBS1等发生高表达（图5e-f）。

BA.2-BTI-6m组上调最多的基因有TMEM176B、TMEM176A、HLA-DQA1、CD52、DNAAF1等，下调最多的基因有TMA7、AC020656.1、SMDT1、DDIT4等（图5g）。功能富集分析显示，BA.2-BTI-6m组MS1相关细胞表现出抗原呈递、T细胞活化和造血调节活性，而核糖体生物发生和ATP代谢过程受到抑制（图5h）。基因集评分的结果与富集分析一致，即骨髓单核细胞表现出抗原呈递活性增加和蛋白质加工活性降低（图 5i）。这些结果表明BA.2-BTI-6m组骨髓细胞的碱性蛋白合成减少，但仍保留了良好的免疫预激活状态。

图5. scRNA-seq用于表征先天免疫细胞的细胞和分子变化。

(a) UMAP图可视化先天免疫细胞的类型和聚类。(b) 小提琴图显示对照组和 BA.2-BTI-6m 组中 NK 细胞效应蛋白的表达水平。(c) 火山图显示两组 NK 细胞中差异表达的基因。(d) 气泡图显示 NK 细胞中差异表达基因富集的生物学功能。(e) UMAP 图显示 CD14 单核细胞亚群。(f) UMAP 图显示 MS1 细胞基因标记的表达水平。(g) 火山图显示两组 MS1 细胞中差异表达的基因。(h) 气泡图显示 MS1 细胞中差异表达基因富集的生物功能。(i) 箱线图显示先天免疫细胞的蛋白质加工和抗原呈递活性评分的差异。

他们进一步分析了九个T细胞亚群之间细胞毒性反应的差异（图 6a），发现BA.2-BTI-6m组的T细胞亚群的细胞毒性是异质的。具体来说，BA.2-BTI-6m组中效应记忆CD8 T细胞(CD8 TEM)的T细胞毒性显著增加，而gdT细胞的T细胞毒性显著降低，这表明BA.2 BTI对其的影响与其他子集相比更持久（图 6b）。他们还关注了 Treg 细胞，它们在感染过程中维持免疫抑制和耐受性方面发挥着重要作用。结果显示，BA.2-BTI-6m组中Treg激活评分或DEG没有显著差异（图 6c），但与Treg活性抑制相关的IRF1基因显著上调（图 6d）。进一步差异分析鉴定出Treg的51个DEG，功能富集表明它们主要参与RNA剪接、对未折叠蛋白的反应、蛋白泛素化的调节和磷酸酶活性（图 6e）。

他们同时检测了T细胞受体(TCR)序列以阐明 T 细胞库的变化。总体而言，除了gdT细胞检测到的TCR序列较少外，T细胞检测到了近50%-60%的TCR（图 6f-g）。TCR克隆多样性分析显示BA.2-BTI-6m和对照组之间没有显著差异，表明BA.2-BTI-6m的TCR库在这个时间点已经稳定（图 6h）。进一步分析表明，不同T细胞亚群之间的克隆扩增存在差异，显著扩增的克隆型主要集中在对照组和BA.2-BTI-6m组的CD8 TEM和效应记忆CD4 T细胞(CD4 TEM)中（图 6j）。这表明记忆 T 细胞水平在接种疫苗或 BTI 后可能会经历持久的动态变化。另外， BA.2-BTI-6m组中度扩增的TCR比对照组高2.637%，而其他类型TCR的差异约为1%（图 6k）。他们分别从对照组和BA.2-BTI-6m组中提取了10个特异性扩增最多的CDR3克隆型序列（图 6l）。正如预期的那样，个体之间的 TCR 存在显著差异，并且共有克隆的比例有限（图 6m-n）。扩增的T细胞上调细胞杀伤效应蛋白，如颗粒酶(GZMB, GZMH)、穿孔素(PRF1)和颗粒蛋白(GNLY)，下调幼稚T细胞标志物，如LTB、IL7R和TCF7等（图6o）。进一步的功能富集分析表明，上调基因主要参与T细胞活化、T细胞分化和宿主防御，而下调基因不仅在T细胞中富集，还参与造血调节、钙离子反应、对拓扑不正确蛋白和未折叠蛋白的反应（图6p）。这些结果表明，BTI 六个月后，扩增和非扩增 T 细胞的功能存在差异。

图6. 表征 T 细胞分子和 TCR 的变化。

(a) 显示 T 细胞亚群和聚类的 UMAP图表。 (b) 箱线图显示两组之间 T 细胞毒性评分的差异。(c) 箱线图显示两组之间 Treg 激活基因集评分的差异。(d) 小提琴图显示对照组和BA.2-BTI-6m组中Treg活性抑制基因的表达水平。(e) 热图显示了Treg差异基因富集的生物学过程。(f) UMAP 图显示带有 TCR 信息的 T 细胞。(g) 条形图显示 T 细胞亚群中检测到的 TCR 比例。(h) 显示单个样本的 TCR 克隆比例的条形图。 (i) 条形图显示两组之间 TCR 多样性的差异。(j) 显示克隆 T 细胞亚群比例的堆积条形图。(k) 圆形图显示对照组和BA.2-BTI-6m组中不同频率TCR的比例。(l) 条形图显示在对照或 BA.2-BTI-6m 组中专门扩增的前 10 个 TCR CDR3 序列。(m) 维恩图显示对照组样本中 TCR 的交集。(n) 维恩图显示BA.2-BTI-6m 组样品的 TCR 交集。(o) 小提琴图显示 CD8 TEM 中前 10 个上调和下调的差异基因。(p) 通过 CD8 TEM 对上调和下调的 DEG 进行功能富集分析。

他们对 B 细胞亚群进行了细分，并确定了四个主要亚群：幼稚 B 细胞 (MS4A1+ IGHD +)、生发中心 B 细胞 (MS4A1+NEIL1 +)、记忆 B 细胞 (MS4A1+ CD27 +) 和中间 B 细胞 (IGHD+CD27+) （图 7 a-b）。活性分析显示，感染后6个月，幼稚B细胞、记忆B细胞和中间B细胞的B细胞受体(BCR)信号和B细胞激活分数仍然显著增加（图 7c）。BA.2-BTI-6m组中幼稚B细胞中显著上调的基因包括HSPA1B、DNAJB1、FOSB、HSP90AA1、IFRD1、HSPA8、PRDX1、HSPH1、FOS等，下调的基因包括RPS26、TMA7、SMDT1 、CRIP1、ARHGAP24、RPL37、RPS29、ATP5F1E、RPS21和RPL37A等（图 7d-e）。KEGG富集分析显示，下调的基因主要参与核糖体和COVID-19通路，而上调的基因参与抗原呈递、IL-17信号通路、MAPK信号通路和感染通路（图7f）。总体而言，除了JAK-STAT信号通路外，抗原呈递、干扰素、B细胞激活和BCR信号传导与各种SARS-CoV-2变体的中和活性呈正相关（图7g）。

他们还检测了 BCR 序列，发现具有配对重链和轻链的 B 细胞亚群约占 40-65%。 （图 7h-i）。BCR库多样性分析显示BA.2-BTI-6m和对照组之间没有显著差异（图 7j），表明受感染的B细胞在六个月后恢复到正常状态。与T细胞不同，他们在BCR中没有发现中频或高频克隆B细胞，而仅发现一些低频扩增克隆型（图 7k）。与对照组相比，在 BA.2-BTI-6m 中观察到扩增 BCR 的比例略高（3.258% vs 2.336%）（图 7k），表明 BA.2-BTI-6m 组中的 B 细胞保留了稍微活跃的状态，可能与 BA.2 诱导的长期免疫激活有关，与血清中和结果一致。 进一步分析表明，检测到的克隆扩增主要集中在中间B、记忆和幼稚细胞聚类中（图 7l）。鉴于该BCR克隆型可能是针对SARS-CoV-2的广谱NAb的来源，他们从BTI和对照组中提取了特异性克隆扩增BCR的CDR3序列（图7m）。其中，CARDRGYNTEGFDYW_CAAWDDSLSGHVF是感染组中比例最高的特定克隆类型。

图7. 表征了 B 细胞分子和 B 细胞受体 (BCR) 的变化。

(a) 显示 B 细胞亚群和聚类的 UMAP 图表。 (b) UMAP 图显示 B 细胞亚群中标记基因的表达。(c) 箱线图显示对照组和 BA.2-BTI-6m 组之间抗原加工和呈递以及 B 细胞亚群的 B 细胞活化评分的差异。 (d-e) 小提琴图显示了幼稚 B 细胞中前 10 个上调和下调的差异基因。(f)差异基因的功能富集分析。 (g) 不同病毒株的抗原呈递、干扰素和B细胞激活模块评分和中和活性之间的相关性。(h) UMAP 图显示带有 BCR 信息的 B 细胞。(i) 条形图显示 B 细胞亚群中检测到的 BCR 比例。(j) 条形图指示单个样本的 BCR 克隆比例。(k) 圆形图显示了对照组和BA.2-BTI-6m组中不同频率的BCR的比例。(l) 堆积条形图显示 B 细胞亚群中克隆亚型的比例。 (m) 条形图显示对照组和 BA.2-BTI-6m 组中扩增最多的特定 BCR CDR3 序列。

他们回顾性分析了与免疫和代谢相关的其他临床参数。特别是，BA.2 BTI后观察到激素紊乱，因为催乳素、雌二醇、T3、T4和皮质醇水平在BA.2 BTI后三个月上调，并且催乳素和皮质醇水平即使在六个月后也没有恢复正常（图8a）。各种激素的协调维持着机体的新陈代谢和功能。催乳素具有激素和细胞因子的生物活性，通过催乳素受体在T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞上的表达，调节细胞免疫和体液免疫。但如果过度活跃，催乳素可能有害。皮质醇在机体的物质代谢、稳态应激反应、免疫功能和各器官的生理功能中起着至关重要的作用。重要的是，肝肾损伤和激素水平异常可引起代谢紊乱，中期血清葡萄糖水平（糖化白蛋白，GA）的极端变化表明，在ba2 BTI后6个月仍未恢复到对照组水平（图8a），这表明糖代谢长期受到影响。皮质醇促进糖原磷酸化酶的激活，这是肾上腺素对糖原分解的作用所必需的。因此，皮质醇的变化可能与免疫和GA异常有关。脂质代谢也受到干扰，脂酶和低密度脂蛋白(LDL)水平分别在BTI后3个月和6个月先下降后上升（图8a），但有恢复趋势。

血常规及蛋白质组学分析均发现凝血功能受损。凝血试验进一步证实了严重损伤，轻度BA.2 BTI后3个月凝血酶原时间活性(PTA)和纤维蛋白原(FIB)水平降低，凝血酶原时间(PT)、PT比值(PTR)、凝血酶时间(TT)和国际标准化比值(INR)升高（图 8b）。特别是，在BA.2 BTI后6个月，PT、PTR、活化的部分凝血活素时间(APTT)、APTT比率和INR随着PTA的进一步降低而进一步增加。TT和FIB水平在BA.2 BTI后六个月恢复到正常水平（图 8b），说明凝血恢复可能需要更长的时间。

图8. BA.2 BTI 康复者与代谢和免疫相关的补充参数以及凝血曲线的变化。

(a) 激素、血脂和血糖的动态水平。(b) 指示凝血系统功能的参数变化。

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