文献解读|Aging Cell（7.8）：转录组和干预证据表明家犬是抗炎研究的有前途的模型

生物衰老是一个复杂的过程，具有 12 个相互关联的特征。动物模型提供了通过针对这些特征进行治疗干预来减缓、停止或逆转衰老的机会。经典的衰老模型，如小鼠、大鼠、果蝇和蛔虫模型，已经成熟且短暂，但它们的具体特征可能与人类还是有一定的差异。恒河猴是最适合人类的模型，但成本、伦理问题、法律考虑、物种保护考虑、寿命和供应限制了非人类灵长类动物的贡献。因此，非常需要模拟人类衰老的额外模型。

狗是一种有潜力的模型，因为它们会自发地产生许多与衰老相关的表型，并与人类经历了趋同进化，并且具有与人类相似的生存曲线。狗模型可能会克服实验室模型的许多局限性，因为它们与人类具有相似的环境和生活方式

研究团队从公安部昆明警犬基地收集了30只警犬，并在相同条件下饲养。这些狗的年龄分别为 1、3、5、7 和 9 岁（图1a）。他们获取血样并进行全血转录组分析(RNA-seq) 。犬、人和小鼠一对一同源基因作为候选基因，这些基因最终分成8个聚类（图S1a-b）。基因在3岁和7岁时表现出显著的表达变化，这可能与大型犬的身体成熟度和高龄/衰老有关，因为它们的身体在22-24个月时成熟。聚类2、3、4、6、7和8的基因表达在青春期3岁时突然发生变化。聚类5中的基因表达仅在7岁时发生显著变化，主要富集粘附和适应性免疫相关的通路，例如生物粘附、细胞粘附、T细胞分化、T细胞激活和调节免疫反应信号通路。这表明细胞粘附和炎症相关的变化发生在早衰期。聚类6中的基因随着年龄的增长逐渐减少，并在RNA、mRNA、tRNA和ncRNA加工和代谢过程中富集。

为了确定衰老中的关键基因，他们使用 maSigPro 与 ImpulseDE2 方法进行比较，分析整个年龄的动态基因谱（图 S1c）。他们发现了61个显著的年龄相关基因(A-AG)，根据不同年龄基因的表达谱，使用Mfuzz v2.52.0软件将这些基因分为6个聚类。61个基因均未与DESeq2鉴定的性别相关差异表达基因(DEG)重叠，表明这些A-AG与性别无关（图 S1d，表1）。

聚类1 中的基因表达在 3 岁后下降，并已证明与发育程序有关（图 1b），例如，FUT10预计有助于皮质细胞迁移和神经元干细胞分裂。聚类2 中的基因在 3 岁后保持稳定，并影响 RNA 剪接和酯交换反应。聚类 3 随着年龄的增长逐渐减少，并参与表皮细胞分化，而聚类 5 随着年龄的增长而增加，影响过氧化物酶体膜运输、脂质分解代谢过程、钠离子运输和 T 细胞共刺激。聚类4 中的基因在骨化中发挥作用；细胞聚集；脊索、头部和感觉器官的发育；这些基因的表达随着年龄的增长而增加，但在7岁后下降。聚类 6中的基因表达在3岁后逐渐增加；TOX可能是该聚类中最有影响力的基因，调节 T 细胞谱系定型、T 细胞和 NK 细胞分化、选择和激活。

图1. 61 个与年龄相关的基因聚类。

(a) 三十只比利时玛利诺犬用于转录组基线。(b) 鉴定出 61 个与年龄相关的基因，这些基因分为具有不同模式的 6 个聚类。

表1. 与年龄相关的基因

图S1.老龄化基线。

(A)跨越年龄的所有基因聚类。(B) 细胞间充质干细胞处理后的所有基因聚类。(C) 两种年龄相关基因鉴定方法的维恩图。(D) 年龄相关基因和性别基因的维恩图。

他们招募了 17 只退役警犬进行抗衰老研究，以评估狗对抗衰老干预措施的反应。比利时玛利诺犬是在比利时马林斯市附近饲养的军用工作犬，而昆明犬则是由中国本土犬与德国牧羊犬杂交培育而成（图 2a）。这些狗的平均年龄为 9 岁，相当于人类的 65 岁。他们将参与的狗分为三组，以进一步检测抗衰老干预措施的效果，这些措施包括使用同种异体犬间充质干细胞 (cMSC)、烟酰胺单核苷酸 (NMN)（NAD+ 的前体） 和雷帕霉素(Rapa)（图 2a）。

由于新陈代谢和免疫功能在衰老过程中变化最大，因此他们在治疗前后测量心率和外周血促炎因子，以评估抗衰老效果。cMSC干预后，平均心率(HRT)和心率储备(HRR)分别显著增加19%和74%；NMN 干预导致平均 HRT 显著增加 11%。然而，这两种情况在 Rapa 组中都不显著。相比之下，cMSC在改善心脏功能方面表现出更好的效果，表明cMSC和NMN治疗可以改善心脏功能（图2b）。

接下来，他们检测了白细胞介素-6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 水平的变化，这两种主要的促炎细胞因子提供了有关全身炎症反应的有价值的信息，并在衰老中发挥着重要作用。所有治疗组中 IL-6 和 TNF-α 均显著降低（图 2c），表明所有三种治疗均有效减少全身炎症。具体而言，与治疗前（54.18、47.31 和 36.67 pg/mL）相比，治疗后 IL-6 减少了四倍多（236.36、198.38 和 277.66 pg/mL）。与治疗前（18.88、18.82 和 12.21 pg/mL）相比，治疗后 TNF-α 减少约两倍（34.97、37.71 和 42.86 pg/mL）。总之，上述研究结果表明狗对抗衰老治疗反应良好。抗衰老治疗后心脏功能和炎症的变化证明了心脏功能和免疫功能的变化是狗衰老过程中的主要标志。

图2. 三种治疗的效果。

(a) 治疗策略、MSC注射和样品收集的示意图。 (b) MSC、烟酰胺单核苷酸(NMN)和雷帕霉素(Rapa)治疗后平均心率（平均HRT）和心率储备(HRR)变化。 (c) 治疗后细胞因子水平的变化。

由于 cMSC 治疗在改善心脏功能和抗炎方面显示出最佳效果，因此他们对接受 cMSC 治疗的狗进行了全血 RNA-seq，以确定其抗衰老作用的潜在机制。他们鉴定了众多DEG，且两组之间的聚类结果存在显著差异。

在MSC治疗前后的比较分析中，他们总共鉴定了2349个基因为DEG，其中1176个基因上调（50.1%），1173个基因下调。这些结果显示，通过REVIGO分析，DEG主要富集在细胞周期、骨髓细胞分化、微管细胞骨架组织和血红素代谢过程的调节中（图 3b），表明cMSC可能在调节细胞更新系统和免疫细胞分化中发挥重要作用。

根据KEGG富集分析，下调的 DEG 在 Wnt 信号传导(cfa04310)以及甲状旁腺激素的合成、分泌和作用(cfa04928)中富集，上调的DEG富集于核糖体(cfa03010)、氧化磷酸化(cfa00190)、细胞周期(cfa04110)和卟啉代谢(cfa00860)通路（图 3c）。cMSC对整个转录组的影响主要富集在细胞代谢、细胞周期和免疫细胞分化等方面，提示cMSC可能通过调节老年犬的细胞衰老和免疫功能来发挥抗衰老作用。

图3. 差异表达基因 (DEG)分析。

(a) 间充质干细胞治疗前后 DEG 的热图。 (b) GO富集结果的REVIGO树图。(c) 下调DEG和上调DEG的KEGG富集分析。

为了检测cMSC 治疗对基线模式的影响，他们结合了基线和 cMSC 治疗数据（图 S1b）。在聚类5中，这种模式在衰老阶段突然增加，并完全向相反方向调节（图4a）。聚类5 中的基因在细胞粘附和迁移、T细胞增殖、白细胞细胞间粘附和间充质形态发生等方面富集（图 4b），这可能表明间充质干细胞靶向细胞粘附和适应性免疫系统。

为了探索潜在的治疗靶基因，他们筛选了61个在cMSC治疗后反向调控的A-AG。在这项研究中筛选了三个潜在的与年龄相关的基因，其中两个与免疫有关（图4c-d）。此外，从3岁开始，CCRL2和PYCR1随年龄的增长而下调，在cMSC治疗后，两者均显著上调，而TOX则下调。有趣的是，CCRL2和TOX与免疫密切相关；CCRL2对募集效应性免疫细胞到炎症部位至关重要，TOX编码的蛋白可能具有调节T细胞发育的功能。

图4. 潜在的治疗靶基因。

(a) 聚类5 仅在 7-9 岁时突然上调（左）。 (b) 干预聚类的富集分析的生物学过程。(c)cMSC 治疗后的三个潜在治疗靶基因的表达变化。(d) 这 3 个关键基因的基线模式。

本项研究获得了30个RNA-seq文库，鉴定了61个动态变化的年龄相关基因，其中大部分与代谢和免疫功能相关，这些基因可能是狗衰老的主要生物标志物。接下来，他们用cMSC、烟酰胺单核苷酸和雷帕霉素治疗老年狗，结果表明，这些治疗可以显著降低炎症因子（IL-6和TNF-α）的水平。间充质干细胞有效改善老年犬的心脏功能。cMSC 治疗可逆转三个关键的潜在年龄相关基因（PYCR1、CCRL2和TOX），其中两个（CCRL2和TOX）与免疫有关。总的来说，本项分析了家养狗的转录组模式，并揭示它们可能是一个很好的衰老模型，特别是在抗炎研究中。

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