文献解读|Nat Commun（16.6）：SETD2缺失加速鞘磷脂积累并促进肾癌的发展

多囊肾病(PKD)患者罹患透明细胞肾细胞癌(ccRCC)的风险很高，透明细胞肾细胞癌是一种脂质代谢失调的恶性肿瘤。组蛋白甲基转移酶 SET 结构域 2 (SETD2) 是 ccRCC 中最常见突变的基因之一，在 ccRCC 发生和进展的功能通路的表观遗传调控中发挥着重要作用。作为甲基转移酶，SETD2 能够通过表观遗传调控或蛋白质修饰来调节细胞信号传导和代谢反应。然而，SETD2 从 PKD 向 ccRCC 转变的分子机制仍不清楚。

为了探索SETD2在体内PKD-ccRCC转变中的潜在作用，研究者团队通过在Ksp启动子的控制下过表达癌基因c-MYC（以下简称KM小鼠）建立了PKD小鼠模型（对照），并使用相同的Ksp启动子敲除SETD2基因的PKD小鼠（以下简称KMS小鼠）中建立ccRCC小鼠模型（图1a）。在20周龄的KM和KMS小鼠中均观察到囊肿（图1b）。值得注意的是，KMS小鼠表现出明显的结构异常，其特征是油红o（一种用于脂质染色的溶色素重氮染料）和羧基酸酐酶9（一种诊断ccRCC的主要标记物）呈阳性染色，而KM小鼠未显示任何肿瘤肿块或脂质积累（图1b-c）。同时，KMS小鼠的寿命比KM小鼠短得多（图1d）。这些结果表明，SETD2缺失增加了PKD小鼠的脂质积累和ccRCC的发生率，突出了SETD2在PDK向ccRCC转变中的代谢调节功能。

为了全面了解SETD2缺失诱导的脂质积累和ccRCC生成的分子机制，他们结合多组学技术对SETD2野生型PKD小鼠模型和SETD2缺失型ccRCC小鼠模型进行了综合分析（图1e）。

图1. SETD2 缺失导致 PKD 小鼠脂质积累和 ccRCC 生成。

(a) PKD和ccRCC小鼠模型建立的示意图。 (b) H&E、油红染色和纵向超声测试的代表性图像。(c) KMS 小鼠表现出更大的异常区域、更厚的肾小管、更大的肾脏体积以及更多的油红和 CA9阳性染色。(d) 小鼠的 Kaplan-Meier 生存曲线。(e) 多组学研究和数据分析的实验流程。

为了确定 PKD-ccRCC 转变过程中 SETD2 缺失影响的代谢过程和代谢物，他们通过激光捕获显微切割 (LCM) 分离并富集 KM 小鼠的肾囊肿和 KMS 小鼠的肿瘤肿块。然后对这些样品进行基于液相色谱-质谱(LC-MS)的非靶向代谢组学和脂质组学分析（图 2a）。他们鉴定出 35 种差异代谢物，KEGG通路富集分析揭示了 SETD2缺失 KMS 样品中脂肪酸生物合成和氨基酸代谢的改变（图 2b）。与 KM 样品相比，鞘磷脂(SM)是 KMS 样品中最显著上调的代谢物（图2c）。SM 是一种占总磷脂 5-10% 的磷酸鞘脂，其特点是鞘氨醇主链与脂肪酸、酰胺键和磷酰胆碱头基连接。值得注意的是，SM 是哺乳动物细胞的重要组成部分，在肿瘤发生中调节信号转导，例如增殖/存活、迁移和炎症。

为了确定 PKD-ccRCC 转变过程中 SETD2 缺失引起的脂质特异性增加，他们接下来在 KM 和 KMS 小鼠模型上进行了非靶向脂质代谢组学分析。使用ClassyFire分类系统，将所有脂质分为九个脂质亚类，包括单酰基甘油（MG，0.46％）、二酰基甘油（DG，0.93％）、三酰基甘油（TG，80.55％）、鞘磷脂（SM，4.17％）、神经酰胺（Cer，4.17%）、葡萄糖神经酰胺（GlcCer，1.39%）、胆固醇酯（CE，5.56%）、甘油磷脂酰胆碱（PC，1.39%）和溶血甘油磷脂酰胆碱（LPC，1.39%）（图2d）。在这些脂质中，只有 SM 显著上调（图 2e）。

与非靶向代谢组学结果一致，与 KM 样品相比，KMS 样品中 SM (d40:1) 和 SM (d41:1) 的脂质增加最显著（图 2f）。这些结果表明 SETD2 缺失导致 PKD-ccRCC 转变期间 SM 含量增加。

图2. 代谢组学分析揭示了 SETD2 缺失的 ccRCC 中鞘磷脂的积累。

(a) KM 和 KMS 小鼠代谢组学分析的示意图。(b) 与代谢物显著改变的 KM 小鼠相比，KMS 小鼠的 KEGG 代谢通路发生了改变。(c) KMS 和 KM 小鼠之间的差异代谢物。(d) 使用 ClassyFire 类别对小鼠肾小管脂质组的化学成分进行分析。(e) KM和 KMS之间代表性脂质的相对丰度。(f) KMS 和 KM 小鼠之间的脂质差异。

为了在 mRNA 和蛋白质水平上进一步表征 PKD-ccRCC 转变过程中 SETD2 缺失引发的生物反应，他们接下来进行了整体转录组学和蛋白质组学分析（图3a）。转录组学分析共鉴定出 1072 个差异基因（图 3b），其中与 KM 小鼠相比，KMS 小鼠有 817 个下调基因和 255 个上调基因（图 3b-c）。蛋白质组学分析共鉴定出 290 个差异蛋白（图 3b），其中与KM 小鼠相比，KMS 小鼠中有 160 个上调蛋白和 130 个下调蛋白（图 3c）。

蛋白质组学数据的KEGG和GO分析表明代谢通路发生了明显的变化（图 3e），这比转录组数据的变化更显著（图 3d）。通过基因集富集分析(GSEA)，他们发现多个通路在蛋白质和mRNA水平上上调或下调，包括上调脂肪酸代谢过程和下调氨基酸代谢（图3f）。这些结果表明 SETD2 确实在 PKD-ccRCC 转变过程中调节广泛的代谢通路。

图3. SETD2缺失的 ccRCC 显示代谢通路改变。

(a) KM 和 KMS 小鼠的转录组学和蛋白质组学分析的示意图。 (b) KM和 KMS小鼠之间前 290 个改变的蛋白质的热图。(c) KM 和 KMS 小鼠之间基因和蛋白质变化的火山图。(d) 基于差异基因显著改变的KEGG通路。(e) 基于差异蛋白显著改变的 KEGG 通路。(f) 基于 AmiGO 数据库中的 GO 分析子集， 对mRNA（x 轴）和蛋白质（y 轴）水平上的上调和下调通路进行 GSEA 分析。

鉴于蛋白质组学分析清楚地表明代谢蛋白与SETD2缺失之间存在紧密联系，他们进一步对蛋白质组学数据集进行GSEA分析，以确定PKD-ccRCC转变期间KEGG代谢通路的改变（图4a）。SETD2 缺失的肾组织中富集的上调通路经常与糖酵解、蛋白质分解代谢和脂质转运和代谢相关。SETD2缺失的肾组织中富集的上调通路通常与糖酵解、蛋白质分解代谢和脂质转运和代谢有关，表现为PKM、CLTC、SLC5A1和TECR等蛋白上调；SETD2缺失的肾组织中富集的下调通路如碳水化合物代谢、TCA循环和氨基酸代谢等，表现为IDH2、CS和GOT2等蛋白下调（图4b）。TCA循环（CS、CSL、ACO2、IDH1、IDH2、IDH3A、IDH3G、sucl2、SUCLG1、FH、MDH1、MDH2、ME1和PCK1）、氨基酸代谢（PSPH、SHMT2、GATM、GAMT、GPT2、GOT1、GOT2、BCAT1和BCAT2）组分下调，以及脂肪酸生物合成（HACD2、HACD3、TECR、THEM4和ACOT7）、碳水化合物吸收（SIS、OPP4、ACE2、SLC5A1、SLC2A2、SLC6A19、SLC16A10、ATP1A1和ATP1A2)、糖酵解（PGM2、PFKL、PFKM、PFKP、ENO3和PKM）的成分变化揭示了SETD2缺失会加速脂质生物合成的代谢重编程（图4c-d）。

与KM样品相比，KMS样品中SM生物合成必需酶TECR、KDSR和LPCAT3蛋白水平升高，棕榈酸、鞘磷脂(d18:1/18:0)、鞘磷脂(d40:1)和鞘磷脂(d41:1)水平升高（图4e-f）。这些结果表明 SETD2 缺失诱导的代谢改变有助于 SM 的从头合成。

图4. SETD2 缺失导致代谢重编程和鞘磷脂生物合成上调。

(a) 与 KM 小鼠相比，KMS 小鼠中 KEGG 代谢通路的 GSEA 富集。(b) KMS 和 KM 小鼠之间上调和下调通路中改变的蛋白质的热图和定量分析。 (c-d) 与 KM 小鼠相比，KMS 小鼠的代谢通路重编程。 (e) 与 KM 小鼠相比，KMS 小鼠中蛋白质和代谢物上调的从头鞘磷脂生物合成示意图。 (f) 与KM小鼠相比，KMS小鼠TECR、KDSR、LPCAT3、棕榈酸、鞘磷脂d18:1/18:0、d40:1和d41:1均增加。

为了进一步检查 SETD2 和 SM 生物合成之间的临床功能相关性，他们分别分析了癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库和临床蛋白质组肿瘤分析联盟 (CPTAC) 数据库。

在蛋白质水平上，小鼠和人ccRCC中分别有17个和38个蛋白质上调和下调，占总差异代谢蛋白质的60.45%（图5a）。具体而言，在小鼠 ccRCC 中，SETD2 缺失引起的上调蛋白（包括 PFKP、SLC16A1、KDSR、LPCAT3 和 CDIPT）以及下调蛋白（包括 HAAO、GOT2、FABP3、IDH3G 和 GLYCTK）也分别持续增加或减少（图 5b）。对 CPTAC 数据库临床蛋白质组数据的 GSEA 分析也显示 SETD2 改变和代谢通路之间具有显著性富集。SETD2与TCA循环和氨基酸代谢中的蛋白水平呈正相关。同时，SETD2的低水平在临床上与糖酵解、蛋白质分解代谢和脂质生物合成中蛋白质的上调有关（图 5c）。

为了进一步验证 SETD2 和 SM 生物合成之间的相关性，他们检测了人类 ccRCC 样本中 SETD2 蛋白和 SM 的水平。免疫荧光 (IF) 染色显示，与邻近正常组织相比，ccRCC 组织中 SETD2 的蛋白水平降低。

然后他们进行了 MALDI 成像质谱 (MALDI-IMS) 来检测人类 ccRCC 和 SETD2 水平改变的正常样本的原位代谢物丰度。结果显示 SETD2 低丰度肿瘤中 SM水平显著增加，包括 SM (40:7;3O, m/z 791.5757)、SM (40:6;3O, m/z 793.5889)、SM (40:7;3O, m /z 791.5757）和SM（40:5;3O，m/z 795.6071），证明SETD2和SM之间存在明显的负相关（图 5d）。总的来说，这些结果表明 SETD2 缺失与人类 ccRCC 中 SM 上调显著相关。

图5. SETD2 缺失与人 ccRCC 中鞘磷脂生物合成上调相关。

(a) 人类和小鼠 ccRCC 中改变的蛋白质对的样本平均、标准化和对数转换变化水平。(b) 与邻近正常肾组织相比，ccRCC 样本中观察到 PFKP、SLC16A1、KDSR、LPCAT3 和 PFKP 蛋白增加，以及 HAAO、GOT2、FABP3、IDH3G 和 GLYCTK 蛋白减少。(c)人ccRCC中SETD2关键蛋白丰度和蛋白水平的相关性。(d) 显示 ccRCC 患者中 SETD2 蛋白水平的代表性免疫荧光图像和来自同一患者的 ccRCC 组织的代表性 MALDI-IMS 图像。

鉴于SETD2缺失会导致SM含量增加，而SM含量与癌症的发生、生长和免疫逃避密切相关，他们假设SM合成抑制剂可以在体内对SETD2缺失诱导的PKD-ccRCC转化具有保护作用。SM的从头合成是由丝氨酸棕榈酰辅酶a与棕榈酰辅酶a缩合而成，然后由丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)催化合成SM。Myriocin是鞘氨醇的类似物，作为一种有效的SPT抑制剂，在体内评估为一种代谢调节剂，对代谢综合征和癌症有良好的作用。

在本项研究中，10周龄的KMS小鼠每2天腹腔注射Myriocin(0.3 mg/Kg)，连续3个月阻断SM的从头合成，每个月进行超声检测（图6a）。在Myriocin处理的KMS小鼠中，与载体处理的KMS小鼠相比，SM水平显著降低。处理前后的超声检测结果显示，Myriocin处理小鼠的肿瘤肿块的大小显著降低（图6b）。Myriocin处理的小鼠体重较轻，肾脏尺寸较小（图6b-d）。形态学上，Myriocin处理小鼠的透明细胞区域比对照小鼠小。进一步的组织学分析表明，与对照小鼠相比，Myriocin处理的小鼠CA9染色减弱，脂质积累减少（图6e-f）。这些结果直观地揭示了利用Myriocin处理后，SETD2缺失引起的ccRCC相关症状得到缓解，PKD向ccRCC的转变发生阻断。

图6. 抑制鞘磷脂生物合成可缓解小鼠SETD2缺失引起的肿瘤发生症状。

(a) 实验流程。(b) 载体和Myriocin处理的 KMS 小鼠肿瘤发育的纵向超声成像。(c-d) 载体和Myriocin处理的 KMS 小鼠的体重和肾脏体积。(e-f) Myriocin处理后的蛋白质水平和组织学变化。

总而言之，这些研究结果表明，SETD2 缺失会诱导广泛且实质性的代谢重编程事件，包括上调糖酵解、蛋白质分解代谢和脂肪酸生物合成，以及下调 TCA 循环和氨基酸代谢。SETD2缺失引起的代谢重编程最终加速了从PKD到ccRCC转变过程中SM的从头合成和肿瘤发生（图 7）。

图7. 在PKD-ccRCC过渡过程中，SETD2缺失在促进大规模代谢重编程和鞘磷脂生物合成中的作用示意图。

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